本文關鍵詞：海南粗榧內(nèi)生真菌CH1307主要次級代謝產(chǎn)物的研究

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【摘要】：藥用植物是天然藥物篩選的最主要途徑,但自從證實了某些內(nèi)生真菌可產(chǎn)生與宿主相同或相似的生理活性成分以來,通過培養(yǎng)藥用植物內(nèi)生真菌以獲得具有藥用活性成分已成為當前研究熱點。目前,海南粗榧(Cephalotaxus hainanensis Li.)是生產(chǎn)抗血癌藥物高三尖杉酯堿(HHT)的原料,但由于該樹種資源極其有限,很難滿足日益增長的臨床需要。因此,篩選海南粗榧內(nèi)生真菌以獲得具有類似HHT或其他活性成分尤為重要。本研究以前期從海南儋州熱帶植物園一株海南粗榧的莖干韌皮部分離的內(nèi)生真菌CH1307 (Alternaria tenuissima)為研究對象。前期研究結(jié)果表明,該菌株有生產(chǎn)HHT的能力,但經(jīng)長期保藏和多次傳代培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)采用動態(tài)搖瓶的發(fā)酵方式,其合成HHT的能力不穩(wěn)定,且該菌株在形態(tài)上存在多變性。因此,本研究首先確認了該菌株是否仍然具備合成HHT的能力；其次,對該菌株進一步分離純化和鑒定,探討經(jīng)多次傳代后菌株是否發(fā)生變化；最后,采用大米固態(tài)發(fā)酵的方式,研究該菌株次級代謝產(chǎn)物粗提物的生理活性,并對其粗提物分離、純化,對獲得的單體化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定及抗癌活性評價。主要研究結(jié)果如下：(1)動態(tài)搖瓶發(fā)酵內(nèi)生真菌CH1307次級代謝產(chǎn)物中HHT的檢測以動態(tài)搖瓶方式發(fā)酵內(nèi)生真菌CH1307,獲得發(fā)酵液40 L后提取生物堿粗提物,采用沉淀反應定性檢測生物堿。后經(jīng)超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(UPLC-MS/MS)及核磁共振波譜(NMR)證實了內(nèi)生真菌CH1307仍然具備一定的合成HHT能力,產(chǎn)量為81.2∥g/L。(2)內(nèi)生真菌CH1307進一步分離純化及分子鑒定對內(nèi)生真菌CH1307進一步分離,觀察到其菌落形態(tài)存在多變性,故依據(jù)菌落直徑及形狀、氣生菌絲形態(tài)及高度、色素產(chǎn)生與否及培養(yǎng)皿正反面顏色等幾個方面將CH1307進一步細分為五個形態(tài)型,分別命名為CH1307a、CH1307b、CH1307c、 CH1307d和CH1307e。經(jīng)顯微觀察發(fā)現(xiàn)這五個形態(tài)型的菌絲形態(tài)具有一定的相似性,但僅觀察到CH1307c有孢子。此外,對五個形態(tài)型菌株的rDNA-ITS區(qū)段比對分析發(fā)現(xiàn),它們的ITS序列相同�；趓DNA-ITS基因片段及形態(tài)學特征,僅能將CH1307的五個形態(tài)型菌株劃分為鏈格孢屬(Alternaria sp.)菌株。(3)大米固態(tài)發(fā)酵菌株CH1307c次級代謝產(chǎn)物粗提物的化合物種類及生理活性以大米固態(tài)發(fā)酵方式對CH1307c做進一步研究。試管定性反應結(jié)果表明,其次級代謝產(chǎn)物的化合物類型豐富,含有酚類、生物堿、黃酮類、皂苷類、甾體類、蒽醌類及揮發(fā)油類等多種物質(zhì)。其次級代謝產(chǎn)物粗提物對七個指示菌(Escherichia coli, Staphylococcu aureus, Bacillus subtilis, Streptococcus agalactiae, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum f.sp. Cubense)均無抑制作用；此外,此粗提物對細胞株K562未表現(xiàn)出抑制活性,但對兩種急性白血病細胞株表現(xiàn)出強細胞毒活性(NB4的IC50.28μg/mL,HL60的IC50=35μg/mL)。(4)大米固態(tài)發(fā)酵菌株CH1307c次級代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定及活性評價以大米固態(tài)方式對菌株CH1307c進行大批發(fā)酵,獲得其乙酸乙酯粗提物浸膏200.4g,采用正相硅膠柱層析、薄層層析(TLC)、半制備液相色譜及重結(jié)晶等方法進行分離、純化,并基于NMR對8個單體化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定。它們分別是：Pestalotiopin A(1)、β-谷甾醇(2)、鏈格孢酚5-O-硫酸鹽(3)、鏈格孢酚甲醚(4)、7-羥基-6-甲氧基香豆素(5)、啤酒甾醇(6)、Oblongolide V(7),3-甲氧苯酚(8)。此外,這八個化合物對白血病細胞株K562和NB4未表現(xiàn)出抑制活性。
【學位授予單位】：海南大學
【學位級別】：博士后
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S791;Q936

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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本文編號：1292913