發(fā)布時(shí)間：2017-12-15 08:19

  本文關(guān)鍵詞：提高法夫酵母合成蝦青素水平的策略及代謝調(diào)控特征分析

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【摘要】：蝦青素(astaxanthin)是一種具有多種生物活性的含氧類胡蘿卜素,可在水產(chǎn)養(yǎng)殖、功能食品、保健品和化妝品等領(lǐng)域應(yīng)用。法夫酵母(Phaffia rhodozyma)是生產(chǎn)蝦青素并作為飼料添加劑的菌株,但其法夫酵母細(xì)胞中蝦青素合成適宜在低溫下進(jìn)行、易受葡萄糖的代謝阻遏等特點(diǎn),限制了其工業(yè)應(yīng)用。本室前期經(jīng)誘變獲得了中溫型耐糖高產(chǎn)蝦青素突變菌株MK19。本研究擬進(jìn)一步探討提高蝦青素產(chǎn)量的策略,并分析高產(chǎn)菌株色素合成代謝流的特征及調(diào)控機(jī)制。實(shí)驗(yàn)證明,由H202和高濃度NaCl刺激產(chǎn)生的氧化壓力,可使MK19蝦青素產(chǎn)量分別提高300%和63%。在菌株生長(zhǎng)前期,添加少量H202(36h添加5mM)和初始NaCl濃度為0.1%(w/v)的條件,最有利于蝦青素的積累。在檢測(cè)類胡蘿卜素組成、色素合成基因轉(zhuǎn)錄、胞內(nèi)過氧化氫酶酶活(CAT)和H202水平的基礎(chǔ)上綜合分析,發(fā)現(xiàn)氧化壓力使更多的萜類化合物代謝流進(jìn)入蝦青素合成途徑；促進(jìn)β-胡蘿卜素和未知色素等合成前體轉(zhuǎn)化為蝦青素；過氧化氫和NaCl的刺激分別提高了色素合成基因crtl和crtE的轉(zhuǎn)錄水平；類胡蘿卜素優(yōu)先于CAT被用于細(xì)胞內(nèi)自由基的清除。在MK19中發(fā)現(xiàn)一種未知色素的積累,通過HPLC、高分辨質(zhì)譜和核磁共振等技術(shù),鑒定其為3-羥基-4-酮基紅酵母烯(HDCO),是法夫酵母中單環(huán)色素合成途徑的主要產(chǎn)物。為了將HDCO進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為蝦青素,成功構(gòu)建了蝦青素合成酶(CrtS)過表達(dá)菌株CSR19,搖瓶培養(yǎng)CSR19的蝦青素產(chǎn)量為25.3 mg/L,較出發(fā)菌株MK19提高了33.5%,且胞內(nèi)蝦青素占總色素比例達(dá)到84%。q-PCR檢測(cè)結(jié)果表明,重組菌株類胡蘿卜素合成基因間具有共調(diào)控的關(guān)系,crtS基因的過表達(dá),刺激了整個(gè)色素合成途徑的活躍。CrtS具有雙功能酶的活性,可以同時(shí)作用在雙環(huán)和單環(huán)色素途徑,并可執(zhí)行催化HDCO向蝦青素轉(zhuǎn)化的功能。不僅提出了法夫酵母中一條新的蝦青素合成途徑,也為有效地控制法夫酵母的培養(yǎng)水平和提高蝦青素產(chǎn)量,提出了可行策略。MK19是目前報(bào)道的耐受初始葡萄糖濃度最高的法夫酵母菌株,是探討菌株脫葡萄糖阻遏機(jī)制的有利材料。對(duì)其代謝產(chǎn)物和相關(guān)基因表達(dá)水平分析發(fā)現(xiàn),crtYB基因的脫糖調(diào)控是MK19細(xì)胞生長(zhǎng)及蝦青素合成耐糖的主要原因。通過5'RACE和啟動(dòng)子截短實(shí)驗(yàn),界定了crtYB基因的功能啟動(dòng)子區(qū)域。在此基礎(chǔ)之上,通過同源比對(duì)和功能驗(yàn)證,首次發(fā)現(xiàn)了法夫酵母中調(diào)控crtYB基因表達(dá)的葡萄糖代謝阻遏子CREA。與野生菌株相比,MK19中不但creA的表達(dá)量低,并且CREA多處于無(wú)活性狀態(tài),導(dǎo)致色素合成基因的轉(zhuǎn)錄脫葡萄糖調(diào)控。本研究結(jié)果,不僅初步解釋了突變菌株脫葡萄糖阻遏的原因,也為進(jìn)一步提高法夫酵母在高濃度葡萄糖下的蝦青素生產(chǎn)能力提供了重要線索。本文探究了調(diào)控氧和碳源兩種重要的生理因素增產(chǎn)蝦青素的策略,不僅為生產(chǎn)蝦青素提供了高產(chǎn)穩(wěn)定的備選菌株,同時(shí)借助代謝產(chǎn)物跟蹤檢測(cè)、基因表達(dá)水平和生物信息學(xué)等相關(guān)分析,揭示了法夫酵母蝦青素合成的兩條途徑及其調(diào)控特征與規(guī)律。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q936
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本文編號(hào)：1291271