本文關(guān)鍵詞：豬瘟病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A切割的機制研究

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【摘要】：作為嚴(yán)格細(xì)胞內(nèi)寄生的微生物,病毒完全利用宿主細(xì)胞的生命維持系統(tǒng)來實現(xiàn)自身的復(fù)制增殖。因此,病毒與宿主細(xì)胞相互斗爭決定了病毒的感染與致病。病毒感染宿主細(xì)胞后,半胱氨酸天門冬氨酸酶(caspases)啟動細(xì)胞程序化死亡(即凋亡),以干擾病毒的復(fù)制,甚至清除病毒。與之相對的是,多種病毒蛋白冒充caspases的底物,利用其水解功能,產(chǎn)生有利于病毒復(fù)制的截斷蛋白。例如,caspase-3、-6和-7共同切割丙型肝炎病毒(HCV)非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A產(chǎn)生的截斷蛋白通過改善感染細(xì)胞內(nèi)環(huán)境以促進(jìn)病毒復(fù)制。與HCV同屬黃病毒科的豬瘟病毒(CSFV),其在復(fù)制過程中是否同樣需要NS5A截斷蛋白目前尚不清楚,為此,本研究對豬瘟病毒NS5A的切割及相關(guān)的分子機制進(jìn)行了研究。為驗證豬瘟病毒NS5A是否發(fā)生切割,豬瘟病毒強毒石門株(Shimen)和豬瘟兔化弱毒C株(C-strain)感染ST細(xì)胞,western blotting檢測發(fā)現(xiàn)Shimen NS5A除了大小約為56k Da的完整蛋白外,還有一個大約40k Da截斷蛋白,而C-strain NS5A僅有約56k Da的完整蛋白。因CSFV感染時NS5A表達(dá)量非常低,Shimen和C-strain NS5A的某些截斷蛋白可能檢測不到。為進(jìn)一步驗證豬瘟病毒株NS5A的切割,構(gòu)建了Shimen和C-strain的NS5A-EGFP過表達(dá)細(xì)胞系,結(jié)果顯示Shimen NS5A除了大小約83k Da的完整蛋白外,還有約68k Da的截斷蛋白b,而C-strain NS5A則能產(chǎn)生約68k Da的截斷蛋白b以及約63k Da的截斷蛋白c。為驗證參與HCV NS5A切割的caspases和calpains家族成員是否參與CSFV NS5A蛋白的切割,利用caspases和calpains家族蛋白酶活性抑制劑分別處理Shimen和C-strain NS5A過表達(dá)細(xì)胞系(P-E-S和P-E-H),結(jié)果顯示caspases家族蛋白酶抑制劑僅能阻斷C-strain NS5A截斷蛋白c的產(chǎn)生,而calpains家族成員則不參與Shimen和C-strain NS5A的切割。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)Shimen和C-strain NS5A 272至275位氨基酸是caspases的結(jié)合基序(D272TTD275)。此外,C-strain NS5A 271位是caspase-6偏嗜切割的頡氨酸,而Shimen NS5A 271位是其非偏嗜切割的丙氨酸。我們推測caspase-6介導(dǎo)C-strain NS5A產(chǎn)生截斷形式c,此外,利用caspase-6抑制劑Z-VEID-FMK處理P-E-H,結(jié)果顯示Z-VEID-FMK能阻斷C-strain NS5A產(chǎn)生截斷蛋白c。此外,利用干擾分子下調(diào)P-E-H細(xì)胞的caspase-6表達(dá)水平,western blotting檢測發(fā)現(xiàn),caspase-6下調(diào)表達(dá)抑制截斷蛋白c的產(chǎn)生。為進(jìn)一步探索caspase-6對C-strain增殖的影響,C-strain感染caspase-6上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系,病毒滴度測定結(jié)果顯示caspase-6上調(diào)表達(dá)不影響C-strain復(fù)制,而下調(diào)表達(dá)則顯著抑制C-strain復(fù)制。然而,下調(diào)caspase-6表達(dá)水平或抑制其活性不影響Shimen復(fù)制。Calpain I和calpain II雖未參與Shimen和C-strain NS5A截斷蛋白的產(chǎn)生,但可保護(hù)Shimen和C-strain NS5A免受未知宿主蛋白的切割。為進(jìn)一步探索calpain I和calpain II是否參與Shimen和C-strain的增殖,calpain I抑制劑ALLN和calpain II抑制劑ALLM分別處理Shimen和C-strain感染的ST細(xì)胞,結(jié)果顯示ALLN和ALLM濃度越高,對Shimen和C-strain復(fù)制的抑制越顯著,表明calpain I和calpain II參與Shimen和C-strain的復(fù)制。為鑒定C-strain NS5A蛋白的caspase-6切割位點,將C-strain NS5A 271位頡氨酸和277位丙氨酸分別突變?yōu)榕cShimen相同的271位丙氨酸和277位蘇氨酸,272和275位天門冬氨酸分別突變?yōu)楣劝彼?成功構(gòu)建了C-strain NS5A 4個不同突變的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。Western blotting顯示275位天門冬氨酸和277位丙氨酸是截斷蛋白c產(chǎn)生的關(guān)鍵氨基酸,而271位頡氨酸和272位天門冬氨酸與截斷蛋白c產(chǎn)生無關(guān)。此外,將Shimen NS5A 277位蘇氨酸突變?yōu)镃-strain NS5A 277位丙氨酸,產(chǎn)生截斷蛋白c;GD53 NS5A 275位谷氨酸突變?yōu)樘扉T冬氨酸產(chǎn)生截斷蛋白c。因此,CSFV NS5A 275位天門冬氨酸、277位丙氨酸是caspase-6切割NS5A產(chǎn)生截斷蛋白c的關(guān)鍵氨基酸位點。此外,為鑒定與C-strain和Shimen NS5A截斷蛋白b產(chǎn)生相關(guān)的關(guān)鍵氨基酸位點,序列對比分析C-strain、Shimen和GD53 NS5A的差異氨基酸位點,結(jié)合截斷蛋白b的大小,將C-strain和Shimen NS5A 371位頡氨酸和373位天門冬氨酸分別突變?yōu)榕cGD53相同的371位亮氨酸和373位谷氨酸,并構(gòu)建了相應(yīng)的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系,western blotting顯示C-strain和Shimen NS5A 371位頡氨酸和373位天門冬氨酸與截斷蛋白b的產(chǎn)生無關(guān)。進(jìn)一步將C-strain NS5A 275、373位天門冬氨酸,335位丙氨酸,362和371位頡氨酸分別突變?yōu)镚D53 NS5A突變?yōu)?75、373位谷氨酸,335為頡氨酸,362位異亮氨酸和371位亮氨酸,構(gòu)建同時突變上述2、3或4個氨基酸的C-strain NS5A穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系,結(jié)果顯示上述突變位點都與C-strain NS5A截斷蛋白b的產(chǎn)生無關(guān)。本研究首次對不同CSFV毒株非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A的切割進(jìn)行了分析,研究發(fā)現(xiàn)caspase-6介導(dǎo)產(chǎn)生的C-strain NS5A截斷蛋白c對病毒復(fù)制具有重要作用,同時也鑒定了C-strain NS5A的caspase-6切割位點。上述研究為進(jìn)一步探索CSFV蛋白加工和病毒復(fù)制的分子機制奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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