本文關(guān)鍵詞：植物PG基因進(jìn)化的研究與白菜雄蕊發(fā)育相關(guān)的兩個(gè)PG基因的表達(dá)分析和功能鑒定

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【摘要】：被子植物的花通常由雌蕊、雄蕊、花瓣和萼片四輪花器官組成,其中雄蕊和雌蕊的精確發(fā)育決定了植物的育性。雄蕊發(fā)育涉及一系列以細(xì)胞壁的降解和松弛為前提的細(xì)胞擴(kuò)張與細(xì)胞分離事件。果膠是雙子葉植物初生細(xì)胞壁的主要成分,同時(shí)也是花粉內(nèi)壁和花粉管壁的重要組成成分。果膠的合成和降解涉及一系列酶的參與。多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonases, PGs)是重要的果膠水解酶之一,它參與到了果實(shí)成熟、器官脫落、花粉成熟等過(guò)程,對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義。PG屬于植物最大的水解酶家族之一。然而,至今人們對(duì)PG家族的科學(xué)分類仍缺乏共識(shí),對(duì)禾本科和雙子葉植物中PG家族結(jié)構(gòu)上的差異的根本原因仍不清楚。激素能調(diào)控雄蕊發(fā)育,那么雄蕊發(fā)育相關(guān)的PG基因是否受到了激素的調(diào)控表達(dá),受到哪些植物激素的影響?這些問(wèn)題都值得我們探討。此外,目前對(duì)PG基因在雄蕊發(fā)育過(guò)程中的功能鑒定的研究仍非常有限,需要我們進(jìn)一步挖掘更多與雄蕊發(fā)育密切相關(guān)的PG基因,并鑒定其功能。本研究針對(duì)以上問(wèn)題,分析了白菜PG基因家族成員的進(jìn)化,比較了PG基因在禾本科和雙子葉植物間進(jìn)化和表達(dá)的異同,篩選了與雄蕊發(fā)育相關(guān)的擬南芥PG基因,并研究了它們?cè)谛廴锇l(fā)育過(guò)程中的表達(dá)動(dòng)態(tài)及其受植物激素的影響,分析了白菜兩個(gè)雄蕊發(fā)育相關(guān)PG基因的表達(dá)和生物學(xué)功能。主要研究結(jié)果與結(jié)論如下：(1)通過(guò)鄰接法對(duì)包括白菜在內(nèi)的5個(gè)陸生植物物種的269個(gè)PG基因構(gòu)建聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)生樹(shù),并進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析不同分枝PG的基因序列特征,估算PG基因編碼序列的進(jìn)化速率、啟動(dòng)子變異以及該兩者的相關(guān)性,結(jié)果表明,植物PG家族能被劃分為7類,不同類別PG基因在序列特征、進(jìn)化速率、啟動(dòng)子變異有其分支特異性。對(duì)啟動(dòng)子變異與編碼序列進(jìn)化速率的回歸分析結(jié)果表明,啟動(dòng)子的進(jìn)化與基因編碼序列的進(jìn)化密切相關(guān)。不同于其他分支成員,Clade A和CladeE的蛋白進(jìn)化較慢、啟動(dòng)子變異卻很大,傾向于遍在表達(dá),它們可能具有古老的起源。對(duì)白菜PG基因按照表達(dá)模式進(jìn)行聚類后,我們發(fā)現(xiàn),不同分支成員在表達(dá)上存在偏向性,其中,Clade C、D和F傾向于在生殖器官中表達(dá),對(duì)植物生殖發(fā)育具有重要意義。此外,表達(dá)分析結(jié)果也暗示劑量效應(yīng)是白菜重復(fù)PG基因保留的主要原因。(2)通過(guò)比較氨基酸序列相似性和分析保守結(jié)構(gòu)域,在5種禾本科植物(二穗短柄草、谷子、高粱、水稻和玉米)和5種雙子葉植物(擬南芥、大豆、苜蓿、楊樹(shù)和蓖麻)中一共鑒定出577個(gè)PG基因。進(jìn)化分析結(jié)果顯示,禾本科和雙子葉植物的PG基因家族在基因重重和丟失模式以及進(jìn)化速率上存在明顯差異。禾本科植物Clade C和Clade F的PG基因的數(shù)量明顯少于雙子葉植物。我們發(fā)現(xiàn)造成這種差異的主要原因是禾本科植物PG家族整體經(jīng)歷了較少的基因重復(fù)和較多的基因丟失。不論是在雙子葉植物還是禾本科植物中,Clade D和Clade E都發(fā)生了較其他大部分分支多的基因重復(fù)。利用已有的基因芯片數(shù)據(jù),我們對(duì)大豆、苜蓿、水稻、玉米和楊樹(shù)PG家族成員的表達(dá)分析結(jié)果顯示,在這兩大類物種中,Clade E成員都具有整體較高的表達(dá)量、并在各個(gè)組織遍在表達(dá),而Clade D的成員可能與雄性生殖密切相關(guān),表明它們的功能在禾本科和雙子葉植物中都非常保守。Clade C和Clade F成員除了可能在兩類物種的生殖發(fā)育中發(fā)揮作用外,它們還可能特異地在雙子葉植物根的發(fā)育中扮演重要角色。(3)基于擬南芥芯片數(shù)據(jù),篩選出14個(gè)雄蕊發(fā)育相關(guān)的PG基因。系統(tǒng)發(fā)生分析結(jié)果表明,雄蕊發(fā)育相關(guān)的PG基因中絕大多數(shù)屬于PG家族的Clade D,還有來(lái)自除Clade A以外的其他分支的成員。對(duì)該14個(gè)PG基因啟動(dòng)子元件的分析結(jié)果表明,這些基因可能主要受到生長(zhǎng)素和赤霉素的調(diào)控表達(dá)。進(jìn)一步構(gòu)建這14個(gè)基因的啟動(dòng)子-GUS融合表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化擬南芥。對(duì)篩選獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化株的組織化學(xué)染色分析結(jié)果顯示,絕大多數(shù)雄蕊發(fā)育相關(guān)PG基因都在絨氈層和成熟花粉粒中表達(dá)。對(duì)經(jīng)過(guò)赤霉素或生長(zhǎng)素處理的擬南芥轉(zhuǎn)化株幼苗的觀察結(jié)果表明,赤霉素和生長(zhǎng)素能夠調(diào)控雄蕊發(fā)育相關(guān)PG基因在幼苗中的表達(dá)。(4)基于大白菜數(shù)據(jù)庫(kù)BRAD的基因組信息,通過(guò)克隆得到BrPG22-1和BrPG22-2的DNA和cDNA全長(zhǎng)。序列比對(duì)分析結(jié)果顯示,BrPG22-1和BrPG22-2的氨基酸序列相似性高達(dá)92.0%。跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)和亞細(xì)胞定位分析結(jié)果表明,該兩個(gè)基因是典型的分泌蛋白。半定量和啟動(dòng)子-GUS融合表達(dá)系統(tǒng)的分析結(jié)果顯示,BrPG22-1和BrPG22-2主要在早期的雄蕊中表達(dá),BrPG22-1還在花絲和胚囊中表達(dá),表明BrPG22-1可能經(jīng)歷了新功能化。通過(guò)反義RNA技術(shù)抑制該兩個(gè)基因的表達(dá)后,轉(zhuǎn)基因植株的花器官形態(tài)、花粉形態(tài)和花粉活力與對(duì)照株相比沒(méi)有明顯差異,表明可能存在其他PG基因與BrPG22-1和BrPG22-2功能冗余。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q943.2
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本文編號(hào)：1285053