本文關鍵詞：亞硝酸鹽型甲烷厭氧氧化細菌培養(yǎng)條件優(yōu)化及其生態(tài)功能

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【摘要】：微生物催化的亞硝酸鹽型甲烷厭氧氧化(N-DAMO)耦合了甲烷厭氧氧化和亞硝酸鹽還原兩個過程,是全球碳氮循環(huán)中的重要一環(huán),也是潛在的廢水生物脫氮工藝。然而,N-DAMO細菌生長極其緩慢,倍增期長達幾周至幾個月。這導致N-DAMO富集物難以獲得,嚴重制約N-DAMO過程的進一步科學研究和工程應用。盡管N-DAMO細菌分布廣泛,但在很多生境中豐度較低,原有PCR引物靈敏度較差,難以檢測一些環(huán)境中低豐度的N-DAMO細菌。本論文通過短期活性試驗和長期培養(yǎng)試驗,優(yōu)化了N-DAMO細菌培養(yǎng)的環(huán)境條件和營養(yǎng)條件,并將優(yōu)化結果應用于N-DAMO細菌的后續(xù)培養(yǎng);從富集物中獲得了N-DAMO新種,并參考新種序列優(yōu)化了NC10門特異性引物;借助新引物以及其他檢測手段,探明了N-DAMO細菌在濱海濕地系統(tǒng)中的生態(tài)功能。主要研究結果如下:1)研究了溫度、pH和鹽度等環(huán)境條件對N-DAMO細菌代謝活性和生長速率的影響,獲得了最佳環(huán)境條件。短期活性試驗結果表明,溫度、pH和鹽度對N-DAMO細菌的代謝活性具有顯著影響。溫度低于35℃時,N-DAMO比活性隨著溫度的增加而指數(shù)上升,溫度高于35℃時,隨著溫度的增加而急劇下降,兩者之間的相互關系可由擴展的阿倫尼烏斯方程描述,最佳溫度約為35℃。在pH測試范圍內(6.0～9.0),N-DAMO比活性隨著pH的增加先增加,后降低,兩者之間的相互關系可由修正的安東尼奧方程描述,最優(yōu)pH約為7.6。高鹽度可抑制淡水N-DAMO細菌的活性,20 g NaCl·L-1鹽度下幾乎檢測不到N-DAMO活性。長期培養(yǎng)試驗表明,溫度、pH和鹽度對N-DAMO細菌的生長也有影響,最佳培養(yǎng)條件為溫度35℃、pH7.6以及鹽度0g NaCl·L-1。特別值得注意的是,在20g NaCl·L-1鹽度下,培養(yǎng)初期富集物并不具有N-DAMO活性,但經(jīng)過90d培養(yǎng)后,富集物中檢測到了明顯的N-DAMO活性,甲烷消耗速率達0.029μmol CH4·h-1。NC10門16S rRNA和pmoA基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,90d培養(yǎng)前后,N-DAMO細菌群落結構并未發(fā)生明顯變化,說明富集物N-DAMO活性的恢復,是由于原有N-DAMO細菌的鹽度適應,而非新的嗜鹽N-DAMO細菌的生長繁殖。據(jù)我們所知,這是首次發(fā)現(xiàn)N-DAMO細菌的鹽度適應現(xiàn)象。2)研究了鐵、銅、鋅、鉬、鈷、錳和鎳等微量元素對N-DAMO細菌代謝活性和生長速率的影響,獲得了最佳配比,并應用于N-DAMO細菌的后續(xù)培養(yǎng)。短期活性試驗表明,亞鐵離子和銅離子對N-DAMO活性具有較明顯的影響。在4～100μmol·L-1范圍內,隨著亞鐵離子濃度增加,N-DAMO活性先明顯增加,后略有回落,在20μmol·L-1附近,獲得最大值。在測試范圍(1～100μmol·L-1)內,隨著銅離子濃度增加,N-DAMO活性先略有增加、后明顯下降,在10μmol·L-1附近,獲得最大值。高濃度銅離子(25～100μmol·L-1)對N-DAMO細菌具有明顯的抑制作用。在測試范圍內,培養(yǎng)基中鋅、鉬、鈷、錳和鎳等元素對N-DAMO細菌沒有顯著影響。長期培養(yǎng)試驗表明,亞鐵離子和銅離子對N-DAMO細菌具有明顯影響,在測試范圍(亞鐵離子4～20μmol·L-1,銅離子1～10μmol·L-1)內,增加亞鐵離子或銅離子濃度,可促進N-DAMO細菌的生長。在測試范圍內,鋅、鉬、鈷、錳和鎳等微量元素對N-DAMO細菌的長期影響小于試驗隨機誤差。因此,改良后的培養(yǎng)基中,亞鐵離子濃度提高至20μmol·L-1,銅離子濃度提高至10μmol·L-1,其他元素濃度保持不變。將改良后的培養(yǎng)基應用于N-DAMO反應器中,發(fā)現(xiàn)應用改良培養(yǎng)基后,N-DAMO細菌的生長速率明顯加快,富集培養(yǎng)速度提高至原來的2～3倍。特別是,應用改良培養(yǎng)基后,N-DAMO細菌形成大而密實的團聚體。比較單個團聚體包含的細胞個數(shù)和培養(yǎng)前后N-DAMO細菌數(shù)量的增加倍數(shù),發(fā)現(xiàn)這些團聚體的成因主要是許多細胞的相互粘附,而非單個細胞的生長繁殖。3)獲得了N-DAMO新種,并參考新種序列,優(yōu)化了NC10門特異性引物,獲得了靈敏度更高的PCR檢測方案。采用細菌通用引物8F/1492R,擴增獲得了N-DAMO新種16S rRNA基因的全長序列。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)該新種廣泛分布于中國生境中,可能有著重要的生態(tài)意義。針對常用NC10門特異性引物存在的缺陷,優(yōu)化了PCR引物。原有引物202F在錯誤的堿基位552～563處具有強結合,存在嚴重非特異性擴增;原有引物qP1F與新種序列在3'端存在堿基錯配。本文設計了新引物1051F,并在引物qP1F中引入簡并堿基(R),用以消除堿基錯配可能帶來的影響。建立了用于NC10細菌16S rRNA基因擴增的新巢氏PCR方案。新方案對NC10細菌具有很強的特異性,并且具有很高的靈敏度。新方案的檢測限約為103 copies·g-1干重,而原方案僅為105 copies·g-1干重。此外,在定量PCR引物qP1F中引入簡并堿基,獲得了更高的NC10細菌豐度,并且NC10細菌豐度與樣品N-DAMO活性之間具有更好的相關性。4)結合分子生物學手段和穩(wěn)定同位素示蹤技術,探明了N-DAMO細菌在濱海濕地系統(tǒng)中的生態(tài)功能。探明了濱海濕地沉積物中甲烷和各類電子受體的垂直分布特征。深層沉積物(3 cm)含有較高濃度的甲烷(最高達32μmol·L-1),表層沉積物(0～0.5 cm)甲烷含量較低(0.3μmol·L-1)。氧氣在沉積物中的滲透深度不足1cm,硝酸鹽/亞硝酸鹽的滲透深度為2～4 cm,硫酸鹽貫穿整個被試沉積物。在次表層沉積物中,甲烷與硝酸鹽/亞硝酸鹽相遇,該區(qū)域易發(fā)生N-DAMO過程。探明了濱海濕地沉積物產甲烷和甲烷氧化速率隨深度變化的規(guī)律。表層和深層沉積物檢測到甲烷凈產生,次表層沉積物(0.5～2 cm)存在明顯的甲烷凈消耗。甲烷好氧氧化、DAMO(包括N-DAMO和nitrate-AOM)和硫酸鹽型甲烷厭氧氧化過程分別主要發(fā)生于表層、次表層和深層沉積物中,活性分別為0.5～1.6、1.4～3.2和0.7～3.0 nmol CH4·day-1·mL-1濕泥。探明了濱海濕地沉積物中甲烷氧化微生物的菌群結構特征。沉積物中甲烷氧化微生物具有明顯的分層分布特征:MOB主要存在于表層沉積物中;DAMO微生物(包括N-DAMO細菌和DAMO古菌)主要存在于次表層沉積物中,隸屬于NC10門的N-DAMO細菌是主要的DAMO微生物;ANME主要存在于深層沉積物中。定量PCR結果也表明,N-DAMO細菌主要存在于次表層。該項研究表明,N-DAMO過程是被試濱海濕地重要的沉積物甲烷匯,貢獻率為23～58%。特別是,N-DAMO細菌的存在使得整個被試濱海濕地成為大氣甲烷匯,甲烷氧化速率為0.10～0.18 nmol CH4·day-1·cm-2。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：X172;X703

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