本文關(guān)鍵詞：玉米抗旱miRNAs及其靶基因的發(fā)掘與功能驗(yàn)證

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【摘要】：MicroRNA(miRNA)是一類非編碼的內(nèi)源小RNA分子,在生物體的生命活動(dòng)中起著重要的調(diào)控作用。miRNAs通過調(diào)控靶基因的表達(dá)來參與生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、分化增殖和細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過程�，F(xiàn)在對(duì)于植物miRNA的研究仍然以擬南芥、水稻等模式植物為主,但是在其他一些植物中仍然有大量的物種特異的miRNA沒有被發(fā)現(xiàn)。玉米是全世界種植最廣泛的作物,同時(shí)也是重要的糧食作物之一,而干旱是限制玉米產(chǎn)量的主要因素之一,抗旱育種一直是研究者們重要的育種目標(biāo),因此通過耐旱miRNA的鑒定來挖掘抗旱相關(guān)功能基因不僅有助于深入理解玉米抗旱機(jī)制,而且對(duì)培育玉米抗旱新品種提供有效途徑。本研究通過利用高通量測(cè)序技術(shù)鑒定兩個(gè)玉米自交系中差異表達(dá)顯著的新miRNAs,并對(duì)差異表達(dá)顯著的新miRNAs進(jìn)行分析和靶基因的預(yù)測(cè),在此基礎(chǔ)上利用轉(zhuǎn)基因方法過量表達(dá)miRNA的靶基因來進(jìn)行功能鑒定和作用機(jī)制分析。獲得如下主要結(jié)果:1、通過高通量測(cè)序技術(shù)總共鑒定了192個(gè)玉米miRNAs,包括124個(gè)已知的miRNAs和68個(gè)新的miRNAs。68個(gè)新的miRNAs中有18個(gè)miRNAs的序列頻率極低并且長(zhǎng)度超過24 nt,莖環(huán)引物熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)果顯示14個(gè)miRNAs在兩個(gè)玉米自交系中檢測(cè)到表達(dá)量。2、對(duì)鑒定的192個(gè)玉米miRNAs進(jìn)行篩選得到了29個(gè)在兩個(gè)玉米自交系中差異顯著性表達(dá)的miRNAs,包括18個(gè)下調(diào)miRNAs和11個(gè)上調(diào)miRNAs,其中有5個(gè)新的miRNAs:PC-3p-190,PC-3p-104764,PC-3p-129630,PC-3p-552502和PC-5p-139812。對(duì)這5個(gè)新miRNAs進(jìn)行靶基因的預(yù)測(cè)和GO注釋分析,發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)的9個(gè)靶基因中,7個(gè)靶基因的GO注釋可以劃分為21個(gè)生物學(xué)過程,包括固碳作用、光合作用、蛋白水解作用等,而另外兩個(gè)靶基因沒有預(yù)測(cè)到任何生物學(xué)功能。此外,5個(gè)miRNAs中有4個(gè)miRNAs擁有共同的靶基因(GRMZM2G448344),PC-3p-104764和PC-3p-129630也擁有共同的靶基因(GRMZM2G360821 and GRMZM2G308907),且這些靶基因都參與光合作用。3、根據(jù)已公布的玉米18個(gè)組織的RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)9個(gè)靶基因進(jìn)行表達(dá)模式的分析,結(jié)果顯示9個(gè)靶基因具有不同的表達(dá)模式,但是都只在葉片中表達(dá),其中GRMZM2G360821和GRMZM2G308907的表達(dá)水平最高,說明這些靶基因可能在植物的光合作用中扮演著重要的角色,而這與上述靶基因的GO注釋分析結(jié)果相一致。4、通過Stem-loop RT-PCR方法檢測(cè)到ZmmiR139的表達(dá)量與其靶基因ZmDST44的表達(dá)量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)性,初步驗(yàn)證ZmDST44是ZmmiR139的靶基因;然后利用5'RACE方法驗(yàn)證ZmmiR139對(duì)ZmDST44的剪切作用,通過測(cè)序得到有41個(gè)測(cè)序結(jié)果正確且其剪切位點(diǎn)為同一位置。因此,通過Stem-loop RT-PCR及5’-RACE實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了ZmmiR139及其靶基因ZmDST44之間的相互作用。5、過量表達(dá)ZmDST44的轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型擬南芥在正常條件下的生長(zhǎng)表型沒有明顯差異,而干旱脅迫條件下,轉(zhuǎn)基因擬南芥相對(duì)于野生型具有明顯的抗旱表型;通過測(cè)定野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株在PEG 6000處理下的萌發(fā)率和在干旱脅迫條件下的丙二醛含量,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株在PEG 6000處理下的萌發(fā)率顯著高于野生型植株,四個(gè)轉(zhuǎn)基因株系在干旱脅迫條件下的丙二醛含量均顯著低于野生型植株,說明過量表達(dá)ZmDST44能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐旱性。6、過量表達(dá)ZmDST44的轉(zhuǎn)基因水稻和野生型水稻在正常條件下的生長(zhǎng)表型沒有明顯差異,而干旱脅迫條件下,轉(zhuǎn)基因水稻相對(duì)于野生型具有明顯的抗旱表型。此外,在干旱脅迫過程中,轉(zhuǎn)基因水稻的葉片相對(duì)含水量顯著高于野生型植株,表明過量表達(dá)ZmDST44可以提高植株在干旱脅迫條件下的保水能力。復(fù)水試驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)基因株系的存活率顯著高于野生型株系。結(jié)合以上結(jié)果,說明過量表達(dá)ZmDST44基因能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因水稻的抗旱能力。綜上所述,本研究通過發(fā)掘玉米抗旱新miRNA來發(fā)掘抗旱相關(guān)功能基因,通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法驗(yàn)證了ZmmiR139及其靶基因ZmDST44之間的相互作用,最后利用轉(zhuǎn)基因方法驗(yàn)證了過量表達(dá)ZmDST44基因可以提高轉(zhuǎn)基因水稻和擬南芥的耐旱性。本項(xiàng)研究的結(jié)果不僅為利用基因工程方法改良作物的抗逆性提供了優(yōu)良的基因資源,而且為玉米抗旱分子機(jī)制的解析奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：S513;Q943.2

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本文編號(hào)：1283126