本文關(guān)鍵詞：禽偏肺病毒F蛋白介導(dǎo)膜融合及抑制β-干擾素機制研究

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【摘要】：禽偏肺病毒(Avian metapneumovirus,aMPV)屬于副黏病毒科肺病毒亞科肺病毒屬。aMPV感染火雞引起火雞鼻氣管炎(Turkey rhinotracheitis,TRT),感染雞引起腫頭綜合征(Swollen head syndrome,SHS),aMPV感染對養(yǎng)禽業(yè)造成經(jīng)濟損失和嚴重威脅。aMPV入侵宿主細胞需要病毒囊膜和細胞膜融合,這一過程是由融合蛋白(Fusion,F)介導(dǎo)的。然而,aMPV F蛋白介導(dǎo)膜融合的機制尚不清楚。另外,aMPV感染造成繼發(fā)感染病毒或細菌,但這種免疫抑制效應(yīng)尚不清楚。本研究旨在闡述aMPV F蛋白介導(dǎo)膜融合機制和aMPV免疫機理。aMPV和人偏肺病毒(Human metapneumovirus,hMPV)都屬于肺病毒屬。對于hMPV,胰酶和低pH誘導(dǎo)F蛋白介導(dǎo)膜融合呈現(xiàn)毒株依賴性。本研究中發(fā)現(xiàn)三個亞型的aMPV(aMPV/A,aMPV/B和aMPV/C)F蛋白介導(dǎo)細胞融合不需要胰酶。添加胰酶可以促進aMPV/C F蛋白融合活性。通過突變F蛋白100或101位點的氨基酸,發(fā)現(xiàn)胰酶調(diào)節(jié)aMPV F蛋白的融合活性是由100和101位點決定。另外,低pH環(huán)境不能促進aMPV/A和aMPV/B F蛋白融合活性,但能促進aMPV/C F蛋白融合活性。突變F蛋白294位點的氨基酸,發(fā)現(xiàn)低pH調(diào)節(jié)aMPV F蛋白的融合活性是由殘基294G決定的。剖析aMPV F蛋白介導(dǎo)細胞融合所需基本條件有助于理解aMPV入侵機制。aMPV F蛋白裂解不依賴外源性的胰酶,意味著內(nèi)源性的蛋白酶就可以裂解aMPV F蛋白,但是宿主中的裂解酶尚未確定。我們發(fā)現(xiàn)跨膜絲氨酸蛋白酶(Transmembrane serine protease 12,TMPRSS12)有助于裂解aMPV/B F蛋白。過表達TMPRSS12提高aMPV/B F蛋白的裂解程度、融合活性和aMPV/B復(fù)制。干擾TMPRSS12降低aMPV/B F蛋白的裂解程度、融合活性和aMPV/B復(fù)制。另外,我們發(fā)現(xiàn)aMPV/B F蛋白的100和101位點被TMPRSS12識別,并證實HDS(組氨酸,天冬氨酸,絲氨酸)三聯(lián)體是TMPRSS12催化核心。重要的是我們發(fā)現(xiàn)TMPRSS12的mRNA在aMPV的靶器官存在。以上結(jié)果說明TMPRSS12有助于裂解aMPV/B F蛋白,為aMPV的預(yù)防與治療提供技術(shù)支持。裂解的aMPV F蛋白介導(dǎo)膜融合的前提是與細胞表面的受體結(jié)合,但是aMPV F蛋白受體尚不清楚。已知的aMPV/B F蛋白含有保守的RDD基序。我們假設(shè)RDD與細胞表面的整合素結(jié)合啟動F蛋白介導(dǎo)膜融合。為驗證我們的假設(shè),首先我們證實封閉整合素的多肽降低了aMPV/B F蛋白融合活性和病毒復(fù)制。同時我們通過抗體阻斷,干擾試驗和過表達確定是aMPV/B F蛋白融合活性和病毒復(fù)制所需的是整合素αv和β1。其次,過表達整合素αv和β1使得aMPV/B F蛋白和aMPV能在非允許細胞系分別吸附和感染。最后突變RDD成RAE,aMPV/B F蛋白吸附能力和融合活性顯著下降。以上結(jié)果說明整合素αvβ1是aMPV/B F蛋白受體,促使aMPV/B F蛋白介導(dǎo)膜融合和aMPV/B感染。臨床觀察aMPV感染引起免疫抑制,但是免疫機理尚未闡明。I型干擾素(Type I interferons,IFN-I)像β-干擾素(Interferon-β,IFN-β)是機體防御的重要組分,在抵抗病毒和細菌感染中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)aMPV/B感染的雞和DF-1細胞后,IFN-β的表達降低。我們進一步證實是aMPV/B F蛋白抑制IFN-β的產(chǎn)生。突變aMPV/B F蛋白的100,101,93位點發(fā)現(xiàn)aMPV/B F蛋白裂解水平?jīng)Q定aMPV/B F蛋白抑制IFN-β程度。干擾試驗和多肽阻斷證實aMPV/B F蛋白下調(diào)IFN-β通過Toll樣受體3(Toll-like receptors 3,TLR3)和Toll樣受體4(Toll-like receptors 4,TLR4)途徑,干擾試驗和流式分析證實aMPV/B F蛋白下調(diào)IFN-β與簇分化抗原14(Cluster of differentiation 14,CD14)有關(guān)。重要的是aMPV/B F蛋白降低脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)的免疫效應(yīng)。以上結(jié)果說明aMPV/B引起雞的免疫抑制好像是通過F蛋白與CD14結(jié)合從而降低IFN-β的產(chǎn)生。aMPV F蛋白介導(dǎo)膜融合需要經(jīng)過裂解和結(jié)合受體的過程,剖析這些過程有助于了解aMPV的入侵和感染。上述研究證實,aMPV F蛋白的100,101和294位點決定胰酶和低pH調(diào)節(jié)F蛋白融合活性。我們進一步揭示aMPV/B F蛋白裂解不需要胰酶的原因是TMPRSS12可以裂解aMPV/B F蛋白。而且發(fā)現(xiàn)整合素αvβ1是aMPV/B F蛋白和aMPV/B感染的受體。另外,我們證實aMPV/B F蛋白裂解程度決定IFN-β表達量,同時發(fā)現(xiàn)CD14參與aMPV/B F蛋白下調(diào)IFN-β。本研究闡明了aMPV F蛋白介導(dǎo)膜融合機制和aMPV免疫抑制機理,有助于理解aMPV的發(fā)病機制。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：S852.65

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本文編號：1281687