本文關(guān)鍵詞：小分子化合物對(duì)RecQ解旋酶家族成員活性影響的研究

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【摘要】：解旋酶可以利用核苷三磷酸水解過(guò)程所釋放出的能量來(lái)沿著核酸鏈進(jìn)行移動(dòng),進(jìn)而完成解開(kāi)核酸雙鏈并使其分離的整個(gè)反應(yīng)。作為解旋酶的代表,RecQ解旋酶家族是一類能夠在維護(hù)染色體基因組和端粒穩(wěn)定性方面發(fā)揮巨大作用的蛋白因子。更為重要的是,在人類中該家族成員(BLM,WRN和RECQ4)的遺傳突變會(huì)形成三種嚴(yán)重的疾病,分別是Bloom,Werner和Rothmund-Thomson綜合癥,而這些疾病又會(huì)伴隨著較高癌癥風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)生。此外,該家族的另一個(gè)成員,RECQL解旋酶,可能會(huì)與乳腺癌和胰腺癌的發(fā)生之間存在關(guān)聯(lián)。在解旋酶發(fā)揮生理作用的時(shí)候,某些小分子化合物可以起到調(diào)節(jié)或是影響解旋酶活性的作用,如三磷酸腺苷可以通過(guò)調(diào)節(jié)蛋白的聚集體狀態(tài)從而影響其對(duì)核酸底物的解旋能力。另外,某些重金屬化合物也可能會(huì)對(duì)解旋酶的活性造成潛在影響,例如氯化鎘的攝入或是BLM蛋白的缺失都會(huì)導(dǎo)致相同的姐妹染色單體交換增加的細(xì)胞學(xué)現(xiàn)象,這就暗示了鎘和BLM之間可能存在某種相互聯(lián)系。所以,為了明確小分子對(duì)解旋酶活性的影響,本次實(shí)驗(yàn)選取了兩組研究對(duì)象,即RECQL和三磷酸腺苷,以及BLM和氯化鎘,之后詳細(xì)分析了各自之間的依賴關(guān)系以及由此產(chǎn)生的解旋酶活力的變化。實(shí)驗(yàn)中,首先利用了原核表達(dá)系統(tǒng)并經(jīng)親和,離子交換或凝膠過(guò)濾層析純化技術(shù)獲得了高純度的蛋白樣品,之后再使用動(dòng)態(tài)光散射分析,熒光各向異性測(cè)定,熒光共振能量轉(zhuǎn)移結(jié)合停流光譜技術(shù)等手段研究了小分子對(duì)解旋酶諸多方面的影響,其中包括了聚集體狀態(tài),DNA底物結(jié)合和解旋活性等方面,希望借此以豐富人們對(duì)于解旋酶的整體認(rèn)知。三磷酸腺苷影響RECQL活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:(1)自然狀態(tài)下的RECQL是以四聚體的形式存在。但是,當(dāng)?shù)鞍着cATP結(jié)合之后,則會(huì)迅速解離為穩(wěn)定存在的二聚體形態(tài),即ATP是調(diào)節(jié)RECQL組裝形式的開(kāi)關(guān)。另外,RECQL突變體蛋白,RECQL49-616和RECQLWH-AAA,則分別呈現(xiàn)為均一的二聚體和單體狀態(tài)并且不能被加入的ATP所改變;(2)不同聚集體形式的蛋白與DNA結(jié)合時(shí)的親和力也不同。其中,四聚體的RECQL和二聚體的RECQL49-616分別對(duì)平齊的雙鏈DNA和單鏈DNA親和力最高。此外,在結(jié)合G4 DNA時(shí),RECQL明顯依賴于其3’端存在的單鏈DNA尾巴;(3)受ATP影響的不同形式的蛋白組裝狀態(tài)對(duì)應(yīng)了不同的活性,其中,四聚體蛋白負(fù)責(zé)退火而二聚體起到解旋的作用;(4)利用多轉(zhuǎn)換下變化3’端單鏈DNA長(zhǎng)度,穩(wěn)態(tài)解旋分析以及改變ATP濃度引起的解旋變化等動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn),證明了RECQL是以一種均一穩(wěn)定的二聚體形態(tài)參與解旋過(guò)程的;(5)不同聚集體狀態(tài)的蛋白在解旋時(shí)存在底物偏好性,其中RECQL解旋Holliday連接體的能力較強(qiáng),而RECQL49-616更傾向于處理雙鏈DNA結(jié)構(gòu);(6)首次發(fā)現(xiàn)RECQL能夠解旋G4類型DNA底物,而RECQL49-616有微弱地解旋Holliday連接體的能力。本次研究第一次成功地使用了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)并結(jié)合蛋白純化技術(shù)獲得了質(zhì)量較好的牛RECQL解旋酶,并且首次利用停流-FRET技術(shù)對(duì)該酶的活性加以分析,最終明確了ATP在RECQL聚集體形態(tài)和活性變化中所起的調(diào)控作用,同時(shí)也證明了該蛋白在解旋時(shí)的工作狀態(tài)應(yīng)該是二聚體形式。這些發(fā)現(xiàn)為深入闡明RECQL的工作機(jī)理奠定了重要基礎(chǔ)。鎘影響B(tài)LM活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:(1)鎘可以造成BLM解旋和ATP酶活力的嚴(yán)重喪失;(2)BLM上存在有兩種對(duì)鎘親和力不同的半胱氨酸殘基類群;(3)鎘能夠強(qiáng)烈抑制BLM的DNA結(jié)合能力,而這種影響是通過(guò)鎘與蛋白表面半胱氨酸的巰基基團(tuán)相結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)的;(4)與現(xiàn)有報(bào)道不同的是,在BLM結(jié)合活性受到抑制的過(guò)程中,蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)域可能只起到了微弱的作用;(5)鎘會(huì)使BLM單體蛋白形成明顯的聚集體復(fù)合物,而EDTA可以逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng);(6)二硫蘇糖醇是鎘抑制蛋白結(jié)合活性所必需的,并且其濃度變化會(huì)對(duì)此抑制過(guò)程造成不同的影響,而EDTA同樣會(huì)抵消這種抑制效應(yīng);(7)鎘對(duì)BLM的DNA解旋活性的阻礙作用不能被EDTA所逆轉(zhuǎn)。本次研究為理解鎘所引起的不依賴于鋅指結(jié)構(gòu)域的BLM失活現(xiàn)象的機(jī)理提供了新的有力線索,同時(shí)也為實(shí)現(xiàn)全面認(rèn)識(shí)BLM在同源重組修復(fù)以及維持基因組穩(wěn)定性方面所扮演的角色這一目標(biāo)提供了重要信息。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q55
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本文編號(hào)：1279681