本文關(guān)鍵詞：小分子化合物對RecQ解旋酶家族成員活性影響的研究

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【摘要】：解旋酶可以利用核苷三磷酸水解過程所釋放出的能量來沿著核酸鏈進行移動,進而完成解開核酸雙鏈并使其分離的整個反應(yīng)。作為解旋酶的代表,RecQ解旋酶家族是一類能夠在維護染色體基因組和端粒穩(wěn)定性方面發(fā)揮巨大作用的蛋白因子。更為重要的是,在人類中該家族成員(BLM,WRN和RECQ4)的遺傳突變會形成三種嚴重的疾病,分別是Bloom,Werner和Rothmund-Thomson綜合癥,而這些疾病又會伴隨著較高癌癥風(fēng)險的發(fā)生。此外,該家族的另一個成員,RECQL解旋酶,可能會與乳腺癌和胰腺癌的發(fā)生之間存在關(guān)聯(lián)。在解旋酶發(fā)揮生理作用的時候,某些小分子化合物可以起到調(diào)節(jié)或是影響解旋酶活性的作用,如三磷酸腺苷可以通過調(diào)節(jié)蛋白的聚集體狀態(tài)從而影響其對核酸底物的解旋能力。另外,某些重金屬化合物也可能會對解旋酶的活性造成潛在影響,例如氯化鎘的攝入或是BLM蛋白的缺失都會導(dǎo)致相同的姐妹染色單體交換增加的細胞學(xué)現(xiàn)象,這就暗示了鎘和BLM之間可能存在某種相互聯(lián)系。所以,為了明確小分子對解旋酶活性的影響,本次實驗選取了兩組研究對象,即RECQL和三磷酸腺苷,以及BLM和氯化鎘,之后詳細分析了各自之間的依賴關(guān)系以及由此產(chǎn)生的解旋酶活力的變化。實驗中,首先利用了原核表達系統(tǒng)并經(jīng)親和,離子交換或凝膠過濾層析純化技術(shù)獲得了高純度的蛋白樣品,之后再使用動態(tài)光散射分析,熒光各向異性測定,熒光共振能量轉(zhuǎn)移結(jié)合停流光譜技術(shù)等手段研究了小分子對解旋酶諸多方面的影響,其中包括了聚集體狀態(tài),DNA底物結(jié)合和解旋活性等方面,希望借此以豐富人們對于解旋酶的整體認知。三磷酸腺苷影響RECQL活性的實驗結(jié)果表明:(1)自然狀態(tài)下的RECQL是以四聚體的形式存在。但是,當?shù)鞍着cATP結(jié)合之后,則會迅速解離為穩(wěn)定存在的二聚體形態(tài),即ATP是調(diào)節(jié)RECQL組裝形式的開關(guān)。另外,RECQL突變體蛋白,RECQL49-616和RECQLWH-AAA,則分別呈現(xiàn)為均一的二聚體和單體狀態(tài)并且不能被加入的ATP所改變;(2)不同聚集體形式的蛋白與DNA結(jié)合時的親和力也不同。其中,四聚體的RECQL和二聚體的RECQL49-616分別對平齊的雙鏈DNA和單鏈DNA親和力最高。此外,在結(jié)合G4 DNA時,RECQL明顯依賴于其3’端存在的單鏈DNA尾巴;(3)受ATP影響的不同形式的蛋白組裝狀態(tài)對應(yīng)了不同的活性,其中,四聚體蛋白負責退火而二聚體起到解旋的作用;(4)利用多轉(zhuǎn)換下變化3’端單鏈DNA長度,穩(wěn)態(tài)解旋分析以及改變ATP濃度引起的解旋變化等動力學(xué)實驗,證明了RECQL是以一種均一穩(wěn)定的二聚體形態(tài)參與解旋過程的;(5)不同聚集體狀態(tài)的蛋白在解旋時存在底物偏好性,其中RECQL解旋Holliday連接體的能力較強,而RECQL49-616更傾向于處理雙鏈DNA結(jié)構(gòu);(6)首次發(fā)現(xiàn)RECQL能夠解旋G4類型DNA底物,而RECQL49-616有微弱地解旋Holliday連接體的能力。本次研究第一次成功地使用了大腸桿菌表達系統(tǒng)并結(jié)合蛋白純化技術(shù)獲得了質(zhì)量較好的牛RECQL解旋酶,并且首次利用停流-FRET技術(shù)對該酶的活性加以分析,最終明確了ATP在RECQL聚集體形態(tài)和活性變化中所起的調(diào)控作用,同時也證明了該蛋白在解旋時的工作狀態(tài)應(yīng)該是二聚體形式。這些發(fā)現(xiàn)為深入闡明RECQL的工作機理奠定了重要基礎(chǔ)。鎘影響B(tài)LM活性的實驗結(jié)果表明:(1)鎘可以造成BLM解旋和ATP酶活力的嚴重喪失;(2)BLM上存在有兩種對鎘親和力不同的半胱氨酸殘基類群;(3)鎘能夠強烈抑制BLM的DNA結(jié)合能力,而這種影響是通過鎘與蛋白表面半胱氨酸的巰基基團相結(jié)合來實現(xiàn)的;(4)與現(xiàn)有報道不同的是,在BLM結(jié)合活性受到抑制的過程中,蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)域可能只起到了微弱的作用;(5)鎘會使BLM單體蛋白形成明顯的聚集體復(fù)合物,而EDTA可以逆轉(zhuǎn)這種效應(yīng);(6)二硫蘇糖醇是鎘抑制蛋白結(jié)合活性所必需的,并且其濃度變化會對此抑制過程造成不同的影響,而EDTA同樣會抵消這種抑制效應(yīng);(7)鎘對BLM的DNA解旋活性的阻礙作用不能被EDTA所逆轉(zhuǎn)。本次研究為理解鎘所引起的不依賴于鋅指結(jié)構(gòu)域的BLM失活現(xiàn)象的機理提供了新的有力線索,同時也為實現(xiàn)全面認識BLM在同源重組修復(fù)以及維持基因組穩(wěn)定性方面所扮演的角色這一目標提供了重要信息。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q55
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本文編號：1279681