本文關(guān)鍵詞：大腸桿菌轉(zhuǎn)錄因子和基因組多位點進化提高生產(chǎn)性能的研究

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【摘要】：大腸桿菌具有遺傳背景清楚、生長迅速和培養(yǎng)簡單等特點,是工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域最常用的宿主菌之一。本論文開展全局轉(zhuǎn)錄因子定向進化技術(shù)和基因組多位點同時進化技術(shù)的研究,以實現(xiàn)對大腸桿菌基因組上多個基因轉(zhuǎn)錄強度或多個基因位點的同時操控,為菌種改良提供了新的思路。本文首先通過進化大腸桿菌全局轉(zhuǎn)錄因子,從而直接或間接的調(diào)控菌體在全基因組規(guī)模上的轉(zhuǎn)錄水平,實現(xiàn)大腸桿菌菌種的改良。首先進化大腸桿菌全局轉(zhuǎn)錄因子CRP提高大腸桿菌中番茄紅素的合成能力。在10L罐上的發(fā)酵實驗中,含有A26T(D8V)的CRP突變子的大腸桿菌番茄紅素產(chǎn)量較對照菌株提高了25%。為闡明突變CRP提高大腸桿菌合成番茄紅素能力的機理,利用基因芯片技術(shù)測定突變菌株的全基因轉(zhuǎn)錄變化情況,和對照菌株比較發(fā)現(xiàn)突變菌株中有396個基因發(fā)生了差異表達,找到了可能影響菌體性狀和目標(biāo)代謝產(chǎn)物合成能力的關(guān)鍵基因群。為了探索大腸桿菌中其它全局轉(zhuǎn)錄因子的作用,通過進化另一個大腸桿菌全局轉(zhuǎn)錄因子FNR,將大腸桿菌對乙醇和丁醇的耐受能力分別提高了30%和28%,驗證了通過轉(zhuǎn)錄因子定向進化實現(xiàn)菌株體內(nèi)多個基因轉(zhuǎn)錄強度同時操控以改良菌株的可行性。本文接著從分析基因組多位點同時進化技術(shù)的機理和操作入手,搭建了一套自動化操作平臺,填補了國內(nèi)基因組自動化進化儀的研究空缺。該裝置通過上位機軟件程序自動控制多軸機械手和多個儀器部件的協(xié)同運作,完成了菌體培養(yǎng)、菌體收集、感受態(tài)細胞的制備、外源基因的添加和電轉(zhuǎn)化等多個實驗環(huán)節(jié),實現(xiàn)了多輪同源重組的自動循環(huán)運行。該裝置僅需4小時即可完成一輪同源重組,自動化連續(xù)運行直至大腸桿菌基因組突變文庫構(gòu)建完成。在此基礎(chǔ)上,開展了寡核苷酸介導(dǎo)的蛋白質(zhì)體內(nèi)進化研究,以提高PQQGDH蛋白的熱穩(wěn)定性和底物特異性為目標(biāo),通過對大腸桿菌基因組上pqqgdh基因的兩個三聯(lián)密碼子引入飽和突變,耦合顏色反應(yīng)的高通量篩選,得到PQQGDH蛋白熱穩(wěn)定性和底物特異性同時提高的菌株,其在55℃下的半衰期提高了4倍,底物特異性提高了50%左右。為降低突變基因庫的構(gòu)建成本,嘗試?yán)皿w外易錯PCR制備雙鏈DNA構(gòu)建突變文庫,對基因組上的dxs基因進行原位進化提高大腸桿菌番茄紅素的合成能力。利用基于顏色的高通量篩選方法,獲得番茄紅素產(chǎn)量提高5倍以上的突變株,并通過基于HPLC的檢測方法測定DXS突變體的酶活。結(jié)果顯示DXS酶活提高是番茄紅素產(chǎn)量增加的直接原因,表明了雙鏈DNA介導(dǎo)的蛋白質(zhì)體內(nèi)進化策略的建立。為提高突變基因庫的同源重組效率,開展了單鏈基因突變文庫的制備研究。通過兩步PCR法制備單鏈DNA突變庫,將同源重組的效率提高到10%,是雙鏈DNA重組效率的100倍。制備得到的單鏈DNA進一步以DNase I酶切,回收獲得90 bp單鏈DNA作為突變文庫,將同源重組的效率提高到15%。利用此策略進化基因組上的dxs基因,將大腸桿菌番茄紅素的合成能力提高了50%,建立了一個具有普遍意義的大腸桿菌基因組多位點快速進化的策略。總之,本文致力于大腸桿菌體內(nèi)多基因的同時操控以改良菌株性狀,建立了全局轉(zhuǎn)錄因子定向進化和基因組多位點同時進化兩種技術(shù)手段。本研究結(jié)果有望在獲得具有工業(yè)應(yīng)用價值的代謝工程菌株研究中發(fā)揮重要的作用。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78

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本文編號：1276698