發(fā)布時間：2017-12-10 14:01

  本文關(guān)鍵詞：擬南芥和玉米糖基轉(zhuǎn)移酶基因參與非生物脅迫耐性的功能研究

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【摘要】：植物生長發(fā)育過程中,次級代謝發(fā)揮著非常重要的作用,而糖基化修飾作為次級代謝過程的一種,有著不可替代的作用。植物體內(nèi)的糖基化修飾是指植物體內(nèi)的糖基轉(zhuǎn)移酶通過催化作用把糖基轉(zhuǎn)移到各種各樣的植物分子上,從而改變這些分子的特性,影響其功能,最終影響植物的生長發(fā)育與環(huán)境互作。然而,糖基轉(zhuǎn)移酶這個超家族大多數(shù)成員的功能并不是很清楚。本研究中主要對擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT79B2/79B3以及玉米糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT787在非生物脅迫響應(yīng)過程中的作用及其機(jī)制進(jìn)行了分析。本論文的主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:1.擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT79B2/79B3的功能研究根據(jù)可公開獲得的芯片數(shù)據(jù)預(yù)測,糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT79B2/79B3可能參與植物的逆境響應(yīng)過程。為了研究這兩個基因的功能,首先通過qRT-PCR技術(shù)調(diào)查了這兩個基因的表達(dá)受逆境誘導(dǎo)的情況。發(fā)現(xiàn)UGT79B2/79B3的轉(zhuǎn)錄水平明顯受鹽、甘露醇、ABA、低溫等多種逆境脅迫的誘導(dǎo)�？寺×颂腔D(zhuǎn)移酶基因UGT79B2/79B3,并構(gòu)建了UGT79B2/79B 的過表達(dá)載體,通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得了高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因純合株系。同時,通過CRISPR/Cas9技術(shù)和RNAi干擾技術(shù),獲得了 ugt79b2/79b3雙突變體和ugt79b2/b3雙RNAi干擾株系。對培養(yǎng)皿中的UGT79B2/79B3的過表達(dá)株系和突變株系進(jìn)行了鹽、甘露醇、低溫、ABA等逆境脅迫處理,調(diào)查了它們在萌發(fā)率、子葉轉(zhuǎn)綠、根長幾個方面了生長變化,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)株系表現(xiàn)出明顯增強(qiáng)的逆境耐受能力,而雙突變株系則對逆境更加敏感。對土壤培養(yǎng)的過表達(dá)系和突變系進(jìn)行了鹽脅迫和干旱脅迫,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)株系有明顯的耐鹽耐旱能力,而突變系耐逆能力降低。同時進(jìn)行了冷凍脅迫實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)過表達(dá)株系耐冷凍能力明顯增強(qiáng),而突變體株系耐逆性降低。脯氨酸和可溶性糖參與植物細(xì)胞的滲透作用,一般作為響應(yīng)逆境脅迫能力的生理學(xué)指標(biāo)。因此,測定了在高鹽、干旱等環(huán)境脅迫下,過表達(dá)株系與雙突變體的脯氨酸和可溶性糖的含量,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)株系中脯氨酸、可溶性糖含量比野生型明顯提高,而雙突變體中的含量明顯降低。還通過qRT-PCR檢測了逆境脅迫下,各株系逆境脅迫相關(guān)基因的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)過表達(dá)株系中的抗逆基因DREB1B、DREB2B、AREB2、RD29A、COR47等明顯上調(diào),而在突變體中這些基因都明顯下調(diào)。為了探討UGT79B2/79B3基因是如何對逆境脅迫做出響應(yīng)的,對UGT79B2/79B3的啟動子區(qū)域進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)UGT79B2/79B3的啟動子區(qū)域含有DRE等多個逆境相關(guān)的響應(yīng)元件。通過對這些元件的定點(diǎn)突變、EMSA實(shí)驗(yàn)、酵母單雜交以及ChIP實(shí)驗(yàn),證明了逆境響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子CBF1/DREB1B能夠直接結(jié)合UGT79B2/79B3的DRE元件并調(diào)控UGT79B2/79B3在逆境下的表達(dá)水平。利用cbf1的突變體和過表達(dá)體也證明了它對UGT79B2/79B3基因表達(dá)的調(diào)控作用。那么UGT79B2/79B3在下游又是如何發(fā)揮耐逆作用的?尋找它們的作用底物將是解開謎團(tuán)的關(guān)鍵。UGT79B2/79B3屬于擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶第Ⅰ家族的成員,理論上催化小分子物質(zhì)的糖基化。通過體外酶促反應(yīng)對植物天然小分子物質(zhì)進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)UGT79B2/79B3能專一性地高效率催化花青素和3-O葡糖糖花青素的鼠李糖基化,對槲皮素、山奈酚只有微弱的活性。對各個轉(zhuǎn)基因株系的總花青素進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)UG79B2/B3過表達(dá)株系中總花青素積累量顯著上升,ugt79b2/79b3雙突變體株系中總花青素含量顯著下降。在連續(xù)光照條件下,發(fā)現(xiàn)UGT79B2/79B3過表達(dá)株系的下胚軸和葉片紫紅色比野生型更深,而ugt79b2/79b3的雙突變體顏色比野生型更淺。另外,在逆境處理下,發(fā)現(xiàn)花青素合成途徑的關(guān)鍵基因在過表達(dá)株系中顯著上調(diào),而在雙突變體中明顯下調(diào)。以上結(jié)果表明,UGT79B2/79B3可能通過花青素途徑發(fā)揮耐逆作用。利用花青素合成途徑的突變體tt18對以上假設(shè)進(jìn)行了進(jìn)一步驗(yàn)證。當(dāng)在花青素合成途徑的突變體tt18的背景下超表達(dá)UGT79B2/79B3時,發(fā)現(xiàn)超表達(dá)體的耐逆性消失。相反,當(dāng)在黃酮合成途徑的突變體tt7背景下超表達(dá)UGT79B2/79B3時,卻發(fā)現(xiàn)超表達(dá)體的耐逆性仍然存在。這一結(jié)果強(qiáng)有力地說明了UGT79B2/79B3是通過花青素途徑而不是通過黃酮途徑發(fā)揮耐逆作用的。植物體在逆境環(huán)境中,會產(chǎn)生大量的活性氧物質(zhì),影響植物體的生長發(fā)育。已有報道花青素能夠清除活性氧,增強(qiáng)抗逆性。測定了過表達(dá)體和突變體總的抗氧化能力,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)體總的抗氧化能力增強(qiáng),突變體則相反。通過DAB和NBT染色實(shí)驗(yàn)也同樣發(fā)現(xiàn)過表達(dá)株系清除活性氧能力加強(qiáng),而突變株系和RNAi干擾株系清除活性氧能力減弱。因此,我們認(rèn)為在逆境脅迫下,轉(zhuǎn)錄因子CBF1等直接調(diào)控了 UGT79B2/79B3上調(diào)表達(dá),通過花青素糖基化促進(jìn)了花青素途徑加快運(yùn)轉(zhuǎn)并造成花青素積累,進(jìn)而通過增強(qiáng)的活性氧清除能力,使植物表現(xiàn)出增強(qiáng)的耐逆性。2.玉米糖基轉(zhuǎn)移酶基因ugt787參與植物耐逆性的研究玉米GT1糖基轉(zhuǎn)移酶家族同樣是一個大的基因家族,包含147個成員。然而功能得到鑒定的卻少之又少。為此經(jīng)過芯片數(shù)據(jù)分析,選擇了一批玉米糖基轉(zhuǎn)移酶的候選基因,對它們進(jìn)行克隆以及原核蛋白的表達(dá)純化,經(jīng)過體外酶活性鑒定,我們發(fā)現(xiàn)UGT787對黃酮類物質(zhì)槲皮素、山奈酚、柚皮素等有催化活性,其中對前兩者的催化活性非常高。由于黃酮類物質(zhì)和植物對逆境的響應(yīng)密切相關(guān),我們對UGT787在逆境下的表達(dá)情況進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)其受到鹽和干旱的明顯誘導(dǎo),同時還發(fā)現(xiàn)UGT787受到槲皮素、山奈酚等底物小分子物質(zhì)的明顯誘導(dǎo),我們還分析了 UGT787在玉米不同生長時期和不同部位的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)UGT787的表達(dá)非常廣泛。因此,我們預(yù)測UGT787在植物體內(nèi)具有重要的功能。我們從Uniform Mu突變體庫購買得到了 UGT787的兩個轉(zhuǎn)座子插入突變體689和943,對它們進(jìn)行了鹽和干旱的脅迫處理,并觀察其生長情況,發(fā)現(xiàn)兩個突變體在種子萌發(fā)、根長、幼苗抗逆方面都表現(xiàn)出敏感的表型。對野生型、689和943三種植株的幼苗提取總黃酮,發(fā)現(xiàn)不管在正常生長條件下還是在逆境脅迫條件下,與野生型相比,689和943都積累了較少的黃酮,說明這可能是689和943對逆境敏感的原因。為了更好地驗(yàn)證UGT787的功能,我們將其在擬南芥中進(jìn)行了超表達(dá),發(fā)現(xiàn)35S::UGT787轉(zhuǎn)基因擬南芥在種子萌發(fā)、子葉轉(zhuǎn)綠率、根長以及土壤中鹽旱等情況下,轉(zhuǎn)基因擬南芥都表現(xiàn)出逆境脅迫增強(qiáng)。結(jié)合UGT787體外酶促反應(yīng)能夠糖基化黃酮類物質(zhì),我們對轉(zhuǎn)基因擬南芥中的總黃酮含量進(jìn)行分析,我們發(fā)現(xiàn)在正常生長條件下和鹽、干旱等脅迫處理?xiàng)l件下,轉(zhuǎn)基因擬南芥中都比野生型積累了更多的黃酮。植物體內(nèi)積累黃酮含量的高低與植物體對抗逆境脅迫的能力具有一致性。為了進(jìn)一步探討玉米糖基轉(zhuǎn)移酶UGT787參與逆境脅迫的機(jī)制,在高鹽、干旱等環(huán)境脅迫下,我們測定玉米突變體689,943與野生型的一些耐逆生理指標(biāo),發(fā)現(xiàn)玉米突變體中脯氨酸、可溶性糖、POD、SOD、CAT、H2O2含量和野生型相比明顯降低。同時我們也測定了擬南芥過表達(dá)株系與野生型的一些耐逆生理指標(biāo),發(fā)現(xiàn)擬南芥中過表達(dá)株系的耐逆生理指標(biāo)都比野生型明顯增加。DAB染色,逆境脅迫下,玉米突變株系中的顏色要比野生型淺,轉(zhuǎn)基因擬南芥中的顏色要比野生型深。表明玉米中突變體株系清除活性氧能力弱,而擬南芥中過表達(dá)株系清除活性氧能力強(qiáng)。檢測玉米突變株系和轉(zhuǎn)基因擬南芥中的黃酮合成途徑相關(guān)基因,逆境脅迫處理后,發(fā)現(xiàn)玉米突變株系中黃酮合成途徑相關(guān)基因下調(diào)表達(dá),轉(zhuǎn)基因擬南芥中黃酮合成途徑相關(guān)基因明顯上調(diào)表達(dá)。緊接著繼續(xù)檢測抗逆相關(guān)基因的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)玉米突變株系中抗逆基因下調(diào)表達(dá),發(fā)現(xiàn)擬南芥中過表達(dá)株系中的抗逆基因KIN1、RD291、RD29B、COR47、POD、GAT等明顯上調(diào)。根據(jù)前人的報道,我們知道植物體內(nèi)的次級代謝物黃酮類物質(zhì)與植物體的抗氧化相關(guān),玉米突變體ugt787中黃酮含量降低,經(jīng)過測定其清除活性氧的能力也降低了,并且對逆境脅迫敏感,而擬南芥過表達(dá)體UGT787中黃酮含量增加,其清除活性氧能力也增強(qiáng)了,同時對逆境脅迫表現(xiàn)出耐受力增強(qiáng)。因此我們推斷,在玉米中UGT787的過表達(dá)體通過糖基化黃酮代謝途徑的槲皮素和山奈酚,推動黃酮代謝途徑的進(jìn)行,進(jìn)而積累更多植物體內(nèi)次級代謝物黃酮,加強(qiáng)了對植物體內(nèi)有毒物質(zhì)活性氧的清除,進(jìn)而增強(qiáng)了植物體對逆境脅迫的抵抗力。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q943.2

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1 李攀;擬南芥和玉米糖基轉(zhuǎn)移酶基因參與非生物脅迫耐性的功能研究[D];山東大學(xué);2017年

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本文編號：1274696