本文關(guān)鍵詞：重組凝血因子VII在CHO細胞中的高效表達

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【摘要】：作為凝血途徑中重要的凝血因子,活化的凝血因子VII(coagulation factor VII,FVII)可以有效克服使用VIII因子治療甲型血友病出血時導(dǎo)致病人產(chǎn)生抗體的缺陷,是目前臨床治療甲型和乙型血友病的最常用藥物,活化的FVII還可用于治療臨床創(chuàng)傷性出血,尤其是高齡產(chǎn)婦分娩出血的治療,我國每年需進口全球唯一重組FVII(recombinant factor VII,r FVII)生產(chǎn)廠商諾和諾德公司(Novo Nordisk)的產(chǎn)品諾其(Novo Seven?)約9億元人民幣。2013年受國家重大新藥創(chuàng)制專項委員會指令性“三重”計劃委托,實驗室團隊與蘇州大學(xué)共同承擔(dān)了r FVII仿制藥物的研發(fā)(重組人凝血因子的研制及臨床前試驗2013ZX09102033),負責(zé)r FVII藥物前體的生物制備工作。按照美國食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration,FDA)和中國FDA(China food and drug administration,CFDA)重組蛋白注射液原料藥生物制備的指導(dǎo)原則,本研究利用中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary,CHO)構(gòu)建了r FVII的表達細胞并懸浮馴化形成工程細胞,用于藥物前體r FVII的表達和生產(chǎn)。通過流加懸浮培養(yǎng)方式提高其表達量,建立了適用于r FVII的高密度培養(yǎng)方法。主要結(jié)果如下:1.通過電轉(zhuǎn)效率和信號肽的優(yōu)化進行r FVII高表達CHO細胞的構(gòu)建。針對電轉(zhuǎn)效率的檢測分析方法,利用FVII一抗和帶有熒光染料的二抗對電轉(zhuǎn)中陽性細胞進行標(biāo)記,進而通過流式細胞儀對電轉(zhuǎn)效率進行精確定量檢測,同時對對電轉(zhuǎn)條件進行了優(yōu)化。優(yōu)化后條件為電壓400 V、質(zhì)粒20μg、電擊三次,并添加鮭魚精子DNA作為攜體DNA,轉(zhuǎn)染效率可達到85%。利用FDA和CFDA認可的CHO細胞作為表達宿主,結(jié)合富含GC的高效表達p MH3質(zhì)粒,構(gòu)建了帶有不同信號肽(Ori,Ig K,Ht,Gl,Mutant)的r FVII表達質(zhì)粒。將帶有不同信號肽的r FVII表達質(zhì)粒電轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)入CHO細胞后,考察不同信號肽對r FVII表達的影響,懸浮培養(yǎng)中帶有信號肽Ig K的表達細胞具有最高的r FVII表達量,達到5.42 mg?L-1,表達量和轉(zhuǎn)錄水平均高于FVII自身信號肽Ori。2.通過流式細胞儀建立高表達克隆高效篩選技術(shù)。針對傳統(tǒng)克隆挑選方法耗時較長和依賴于人工經(jīng)驗的缺點,本文基于流式細胞儀將Ig K表達質(zhì)粒電轉(zhuǎn)后的細胞分選至96孔板,在考察每孔細胞分選數(shù)條件后,確定以每孔3個細胞的條件進行分選并進行克隆篩選,經(jīng)過兩次點雜交和WB檢測后得到一株r FVII高表達CHO細胞。與傳統(tǒng)篩選方法下獲得的細胞相比,兩株細胞在細胞生長和r FVII表達方面并無明顯差異,同時確定了r FVII陽性表達細胞純度約為100%。利用建立的高表達克隆的快速篩選方法,使克隆挑選時間由傳統(tǒng)方法的8個月縮短為目前的兩個月,有效提高了高表達克隆的篩選效率。3.通過高密度培養(yǎng)條件的考察和優(yōu)化提高r FVII在懸浮培養(yǎng)中的表達量。通過考察接種密度和培養(yǎng)溫度,發(fā)現(xiàn)在1.0×106個?m L-1和34℃條件下有利于r FVII的表達,表達量分別達到7.49 mg?L-1和7.18 mg?L-1,而37℃更有利于細胞生長,因此確定階段培養(yǎng)策略,即以1.0×106個?m L-1接種密度、37℃培養(yǎng)3天,之后降溫至34℃并流加補料培養(yǎng)基。在比較了不同商業(yè)SFM后,發(fā)現(xiàn)B001+F001的SFM在3 L搖瓶反應(yīng)器中,采用兩階段培養(yǎng)策略培養(yǎng)后r FVII表達量達到24.51 mg?L-1。在分析流加培養(yǎng)過程中CHO細胞周期的變化后,發(fā)現(xiàn)第3天補充添加F001后使G1/G0期細胞比例提高到80%以上,較高的G1/G0期細胞比例無法被亞油酸和丁酸鈉進一步提高。在5 L生物反應(yīng)器中進行流加補料培養(yǎng)中,細胞密度在第2天至第8天維持在較高水平,培養(yǎng)結(jié)束后在第9天r FVII達到46.3 mg?L-1。4.基于免疫親和層析柱的r FVII高效純化。CHO/r FVII的表達培養(yǎng)基首先經(jīng)過Q陰離子交換柱純化以達到富集的目的,洗脫后r FVII蛋白的得率僅為47.31%,由于較低的蛋白得率沒有達到富集的目的,因此后續(xù)純化中由免疫親和層析柱一步法完成。制備免疫親和層析柱中采用了蘇州大學(xué)合作團隊提供的3G3、9E8、9F11和10E5四種抗體,在考察了四種抗體制備的親和柱對r FVII純化的效果后發(fā)現(xiàn),3G3抗體制備的親和柱純化得率和純度最高,分別為92.3%和91.48%。之后考察了不同p H值和Na Cl濃度對r FVII純化的影響,發(fā)現(xiàn)p H 3.5條件下r FVII純化后得率和純度分別為89.47%和90.31%,而Na Cl溶液不能對r FVII進行有效洗脫。在考察不同r FVII濃度對純化影響時發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)基稀釋5倍后會略微降低r FVII蛋白的得率,濃縮5倍后并不影響r FVII的得率和純度。最終純化策略確定培養(yǎng)基濃縮5倍后,經(jīng)過3G3免疫親和層析柱純化蛋白并在p H 3.5條件下洗脫,純化后r FVII得率為89.6%,純度為92.58%。純化后得到的藥物前體r FVII經(jīng)蘇州大學(xué)合作團隊活化表明具有生物活性。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q78;R554.1

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