本文關(guān)鍵詞：鈣信號在小鼠卵母細胞減數(shù)分裂恢復(fù)中的作用機理

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【摘要】：卵泡壁層顆粒細胞表達的NPPC與其表達在卵丘細胞中的受體NPR2結(jié)合,產(chǎn)生cGMP維持卵母細胞減數(shù)分裂的阻滯。LH通過促進顆粒細胞中EGF樣生長因子的表達轉(zhuǎn)激活卵丘細胞中的EGF受體誘導(dǎo)卵母細胞減數(shù)分裂恢復(fù)。前期的研究表明,LH依賴的EGF受體信號通路升高了卵丘細胞內(nèi)鈣離子水平使NPR2失活,導(dǎo)致cGMP水平下降,卵母細胞減數(shù)分裂恢復(fù)。本研究著眼于探究激活EGF受體升高卵丘細胞內(nèi)鈣離子水平的分子機制,以及卵丘細胞內(nèi)高水平的鈣離子使NPR2失活的分子機理。鞘氨醇-1-磷酸(S1P)動員內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫使胞內(nèi)鈣離子水平升高。S1P由鞘氨醇激酶(SphK)磷酸化鞘氨醇(Sph)產(chǎn)生。SphK有SphK1及SphK2兩個亞型。我們發(fā)現(xiàn)在體外培養(yǎng)的小鼠COCs中,添加 SphK的抑制劑SKI-Ⅱ抑制了 EGF誘導(dǎo)的卵母細胞減數(shù)分裂恢復(fù)與卵丘擴展。UPLC-HRMS技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)體內(nèi)注射hCG或體外添加EGF均能升高COCs中S1P水平,而SKI-Ⅱ則顯著抑制了 EGF誘導(dǎo)的胞內(nèi)S1P水平的升高,說明EGF激活SphK產(chǎn)生S1P。進一步研究表明,MAPK3/1的抑制劑U0126顯著抑制了 EGF誘導(dǎo)S1P水平的升高,說明EGF可能通過MAPK3/1激活SphK。接下來我們發(fā)現(xiàn),SKI-Ⅱ能夠抑制EGF誘導(dǎo)的卵丘細胞內(nèi)鈣離子水平升高,并能顯著逆轉(zhuǎn)由EGF介導(dǎo)cGMP水平的降低,說明胞內(nèi)鈣離子水平升高降低了 NPR2活性。利用卵泡培養(yǎng)模型進行的研究表明,SKI-Ⅱ能夠顯著抑制LH誘導(dǎo)的卵丘細胞內(nèi)鈣離子水平升高、卵母細胞減數(shù)分裂恢復(fù)與卵丘擴展。接著我們利用SphK1-/-;SphK2f-;Cyp19-Cre小鼠研究敲除顆粒細胞中SphK1及SphK2對卵母細胞減數(shù)分裂恢復(fù)的影響。結(jié)果表明,注射hCG4小時后,SphK1-,-;SphK2f/-;Cyp19-Cre小鼠卵母細胞的GVBD率為53.7%±2.4%,低于對照組小鼠(96.3%±0.9%),且注射hCG 2小時后卵丘細胞內(nèi)鈣離子水平也并不上升。超數(shù)排卵實驗表明,SphK1-/-;SphK2f/-;Cyp19-Cre小鼠每只的平均排卵數(shù)為29.3±1.2枚,而對照組小鼠每只平均排卵數(shù)為56.0±3.2枚。此外,我們統(tǒng)計了 5個月內(nèi)小鼠的繁殖情況,發(fā)現(xiàn)SphK1-/-;SphK2f-;Cyp19-Cre小鼠平均每只在5個月內(nèi)共產(chǎn)崽17.8土1.9只,顯著低于對照組小鼠(43.0±6.9只)。下面我們研究了卵丘細胞內(nèi)高水平的鈣離子使NPR2失活的分子機制。在小鼠卵泡中,LH通過激活EGF受體來升高卵丘細胞內(nèi)鈣離子水平,但降低了 NPR2與NPPC的親和性。在體外培養(yǎng)的COCs中,EGF激活EGF受體升高卵丘細胞內(nèi)鈣離子水平升高,降低了 NPR2與NPPC的親和性及cGMP水平。然而LH或EGF均不改變卵丘細胞中NPR2的蛋白水平。此外,添加SKI-Ⅱ逆轉(zhuǎn)了由LH或EGF介導(dǎo)的卵丘細胞內(nèi)NPR2與NPPC親和性下降。這些結(jié)果表明LH-EGF受體信號通路升高卵丘細胞內(nèi)鈣離子水平下降了 NPR2與NPPC的親和性,導(dǎo)致NPR2失活,卵母細胞恢復(fù)減數(shù)分裂。我們還發(fā)現(xiàn),鎂離子與鈣離子作用相反,在維持NPR2功能方面起著重要作用。綜上所述,LH-EGF受體信號通路通過激活MAPK3/1導(dǎo)致SphK的激活,產(chǎn)生S1P升高卵丘細胞內(nèi)鈣離子水平,使NPR2與NPPC親和性下降,cGMP水平下降,卵母細胞減數(shù)分裂恢復(fù)。以上結(jié)果從分子水平上闡明了鈣離子在卵母細胞減數(shù)分裂恢復(fù)中的重要作用,進一步完善了與卵母細胞減數(shù)分裂恢復(fù)相關(guān)的分子機理,同時對臨床研究及應(yīng)用也有一定借鑒意義。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q492

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