本文關(guān)鍵詞：用單分子方法研究解旋酶與G4 DNA的作用機(jī)理

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【摘要】：解旋酶(Helicase)是一類通過(guò)水解三磷酸核苷(通常是三磷酸腺苷(ATP))打開核酸之間氫鍵的馬達(dá)蛋白。其廣泛存在于每個(gè)物種中并且?guī)缀鯀⑴c了核酸代謝的各個(gè)方面。解旋酶突變將會(huì)導(dǎo)致核酸代謝紊亂,甚至?xí)䦟?dǎo)致嚴(yán)重的遺傳性疾病,如人類RecQ家族解旋酶RecQ2/Bloom(BLM)、RecQ3/Werner(WRN)、RecQ4/RTS突變將會(huì)分別導(dǎo)致BLM綜合征、WRN綜合征和Rothmund-Thomson綜合征。這些病人通常表現(xiàn)為基因組不穩(wěn)定及易患癌癥。解旋酶不僅可以解旋傳統(tǒng)的雙鏈結(jié)構(gòu),還可以解旋Holliday連接體、G-四鏈體(G-quadruplex,G4)等復(fù)雜結(jié)構(gòu)。G4是一類非常規(guī)的核酸高級(jí)結(jié)構(gòu)。其基本組成單元是四個(gè)鳥苷酸通過(guò)Hoogsteen氫鍵形成的平面。當(dāng)不少于兩個(gè)鳥苷酸平面被Na+或K+穩(wěn)定,就形成了G4。G4 DNA在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、端粒代謝等生物過(guò)程中都發(fā)揮了極其重要的作用,所以如果G4不能被正確處理將會(huì)導(dǎo)致各種疾病。G4的生物功能是通過(guò)動(dòng)態(tài)的折疊和打開實(shí)現(xiàn)的。在細(xì)胞內(nèi),G4可以自發(fā)折疊,但其打開是由專門的解旋酶來(lái)完成的,例如Pif1、FancJ、BLM、WRN等。在體外理解這類解旋酶解旋G4 DNA的機(jī)制以及G4 DNA對(duì)這類解旋酶的影響有助于預(yù)測(cè)其在體內(nèi)的行為,然后了解它們的生物功能。但由于研究手段的限制,解旋酶與G4 DNA相互作用的分子機(jī)理尚不清楚。近二十年來(lái),單分子技術(shù)(例如光鑷、磁鑷、單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移)的進(jìn)步極大地提升了我們實(shí)時(shí)觀察解旋酶與核酸相互作用的能力。本文利用單分子熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)的優(yōu)勢(shì),系統(tǒng)地探究了解旋酶Pif1、BLM和WRN與G4 DNA的相互作用,揭示了前所未有的反應(yīng)細(xì)節(jié)。Pif1與G4 DNA相互作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:(1)Pif1以位移的方式分步并且往復(fù)打開G4 DNA;(2)Pif1往復(fù)打開G4受到ATP濃度的調(diào)節(jié);(3)Pif1往復(fù)打開G4不需要5’尾鏈;(4)Pif1以單體形式打開G4;(5)G-三鏈體在Pif1往復(fù)打開G4過(guò)程中發(fā)揮重要作用;(6)高濃度Pif1解旋雙鏈DNA前表現(xiàn)出短暫停頓的現(xiàn)象,對(duì)應(yīng)著Pif1同源二聚體的形成;(7)G4可以明顯縮短Pif1解旋雙鏈DNA的等待時(shí)間;(8)G4促進(jìn)解旋的現(xiàn)象在復(fù)制叉處表現(xiàn)的更為明顯;(9)更高濃度的Pif1通過(guò)加快二聚化減少等待時(shí)間;(10)富含G的序列而不是G4結(jié)構(gòu)促進(jìn)Pif1解旋下游雙鏈。BLM與G4 DNA相互作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:(1)G4 DNA在生理?xiàng)l件下可以折疊成兩種結(jié)構(gòu),并且Mg2+也可以穩(wěn)定G4結(jié)構(gòu);(2)BLM解旋G4是依賴于ATP的;(3)當(dāng)G4 3’末端只含有單鏈DNA的情況下,BLM分步階梯式以G-三鏈體、G-發(fā)卡結(jié)構(gòu)為中間狀態(tài)打開G4 DNA;(4)當(dāng)G4 3’端通過(guò)一段單鏈DNA連接雙鏈DNA的情況下,BLM錨定在單雙鏈叉口抽動(dòng)單鏈DNA,擠出單鏈DNA環(huán),循環(huán)打開G4 DNA;(5)BLM打開G4結(jié)構(gòu)的能力較弱,不能打開穩(wěn)定的四層G4結(jié)構(gòu),同時(shí)G4是BLM位移的障礙。WRN與G4 DNA相互作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:(1)WRN在叉狀、單雙鏈和含有G4的DNA結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出循環(huán)解旋現(xiàn)象,顯示出表觀持續(xù)解旋能力弱;(2)WRN可以錨定在單雙鏈叉口抽動(dòng)5’單鏈DNA,誘導(dǎo)單鏈DNA往復(fù)成環(huán);(3)循環(huán)解旋來(lái)自相同WRN沿著同一條單鏈DNA的往復(fù)運(yùn)動(dòng),而不是不同解旋酶的解離和結(jié)合,或相同解旋酶的鏈轉(zhuǎn)換;(4)G4在不同結(jié)構(gòu)環(huán)境下均表現(xiàn)出阻擋WRN位移和解旋下游雙鏈的現(xiàn)象;(5)G4序列的互補(bǔ)鏈或G4 3’端多出的雙鏈錨定位點(diǎn)可以促進(jìn)WRN解旋G4下游的雙鏈DNA。總之,上述解旋酶解旋G4過(guò)程中均表現(xiàn)出分步解旋和循環(huán)解旋的現(xiàn)象但分子機(jī)理不同。而對(duì)于不同的解旋酶來(lái)說(shuō),G4對(duì)于下游雙鏈DNA解旋的影響有時(shí)表現(xiàn)為激活有時(shí)表現(xiàn)出抑制。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q75
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本文編號(hào)：1266498