本文關鍵詞：可逆永生化綿羊成纖維細胞系的建立及其應用研究

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【摘要】：體外培養(yǎng)的動物細胞在生物學研究、細胞治療、轉(zhuǎn)基因及動物克隆等領域均有非常重要的應用價值。但是,從動物組織分離的原代細胞增殖壽命有限,不利于體外連續(xù)傳代培養(yǎng),從而也不利于它們在基因打靶、轉(zhuǎn)基因克隆等領域的應用。研究證明,在正常體細胞中異位表達人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)可以重構(gòu)端粒酶活性,延長細胞壽命。然而,組成型表達hTERT會導致克隆胚胎發(fā)育停滯等問題。因此,本文試圖通過條件性表達hTERT,建立可逆永生化綿羊成纖維細胞系,用于今后家畜體細胞轉(zhuǎn)基因克隆及其它生物學研究。基于Tet-on系統(tǒng),構(gòu)建了hTERT可誘導表達質(zhì)粒載體pTet-onhTEKT。利用電擊轉(zhuǎn)染的方法,將線性化的pTet-on hTERT轉(zhuǎn)染到綿羊胎兒成纖維細胞中。在Dox (doxycyline)的誘導下,最終獲得了6個穩(wěn)定表達hTERT的細胞克隆。6個細胞克隆從96孔板擴增到60mm時,各分成兩組：一組培養(yǎng)液中持續(xù)添加Dox,記為h(+)組；一組培養(yǎng)液中撤銷Dox,記為h(-)組。用RT-PCR和Western blot分別檢測了兩組細胞中hTERT mRNA和hTERT蛋白質(zhì)的表達水平,檢測結(jié)果顯示h(+)細胞中高表達hTERT mRNA和hTERT蛋白質(zhì)。用TRPA (telomeric repeat amplification protocol)法檢測了兩組細胞中的端粒酶活性,結(jié)果證明在h(+)細胞中能夠重構(gòu)端粒酶活性。經(jīng)過120天的連續(xù)傳代培養(yǎng),h(-)組細胞種群增長速率逐漸變慢直至衰老死亡,而h(+)組細胞種群增長速率一直保持穩(wěn)定且細胞狀態(tài)良好。這些結(jié)果證明了,異位表達hTERT能夠使綿羊胎兒成纖維細胞永生化。隨后,將h(+)組細胞又分成兩組：一組培養(yǎng)液中仍添加Dox,仍記為h(+)組：另一組培養(yǎng)液中撤銷Dox,記為h(+-)組。又經(jīng)過130天的連續(xù)傳代培養(yǎng),h(+)組細胞種群增長速率仍保持不變且細胞狀態(tài)良好,而h(+-)組細胞種群增長速率逐漸變慢且細胞形態(tài)扁平,證明了撤銷Dox能夠使永生化細胞發(fā)生逆轉(zhuǎn)。對連續(xù)傳代培養(yǎng)共250天左右的h(+)組細胞進行軟瓊脂克隆形成實驗和染色體核型分析,結(jié)果證明永生化細胞未發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。除此之外,將肌分化因子MyoD轉(zhuǎn)染連續(xù)傳代培養(yǎng)200天的h2(+)細胞。經(jīng)過又一輪的細胞克隆篩選后,得到13個整合了MyoD的細胞克隆。通過RT-PCR,檢測了這13個克隆中MyoD及其它肌肉特異性基因的表達。這一實驗表明,壽命延長的h(+)細胞可以進行再一輪的轉(zhuǎn)基因操作,因此可用于基因修飾和基礎細胞學研究等。成年成纖維細胞較胎兒成纖維細胞取材更方便且不涉及倫理問題,更重要的是成年成纖維細胞作為核供體可以用于優(yōu)良性狀動物個體的克隆以及珍稀和瀕危動物的擴繁及保種。但是,與胎兒成纖維細胞相比,成年成纖維細胞的增殖能力更差,核移植效率也更低。為了解決這一問題,本文又將pTet-on hTERT轉(zhuǎn)染成年綿羊成纖維細胞,篩選得到了壽命延長的細胞克隆A3h38(+)。用連續(xù)傳代培養(yǎng)136天的A3h38(+)細胞與原代成年成纖維細胞分別進行細胞集落形成實驗,結(jié)果表明,A3h38(+)細胞的單細胞集落形成能力及集落擴增能力都顯著高于原代成年綿羊成纖維細胞。然后,用連續(xù)傳代培養(yǎng)80天的A3h38(+)細胞與原代成年成纖維細胞分別作為核供體進行核移植,結(jié)果顯示A3h38(+)細胞作為核供體的克隆胚胎囊胚率比原代成年成纖維細胞顯著提高。因此,建立永生化成纖維細胞系將為家畜體細胞的基因修飾及轉(zhuǎn)基因克隆提供寶貴材料。
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：Q813

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