本文關(guān)鍵詞：解析內(nèi)生細(xì)菌Pantoea ananatis Sd-1的木質(zhì)纖維素降解體系研究

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【摘要】：隨著能源消耗的迅速增加,人類面臨著資源緊缺和環(huán)境惡化方面越來越嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。通過將可再生木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為液體燃料和有用化學(xué)品,有助于實現(xiàn)人類社會的可持續(xù)發(fā)展,并帶來巨大的經(jīng)濟(jì)和社會效益。然而,木質(zhì)纖維素材料結(jié)構(gòu)的組成復(fù)雜,嚴(yán)重限制了其高效轉(zhuǎn)化和發(fā)展生物煉制。因此,開發(fā)高效的木質(zhì)纖維素降解資源多年來一直受到研究者的關(guān)注。越來越多的研究顯示,由于具有極強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性和豐富的生化多樣性,細(xì)菌將在木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化過程中扮演越來越重要的角色。但是,與真菌相比,細(xì)菌降解木質(zhì)纖維素的研究起步較晚,現(xiàn)有的文獻(xiàn)報道對細(xì)菌降解木質(zhì)纖維素的理解還很不全面,其木質(zhì)纖維素降解酶和降解途徑仍有待發(fā)掘,迫切需要對其降解體系及機(jī)制開展研究。本文以前期分離出的一株具有高效降解木質(zhì)纖維素能力的水稻內(nèi)生細(xì)菌Pantoea ananatis Sd-1為研究對象,對其降解特性和相應(yīng)的降解體系及作用機(jī)理開展了系統(tǒng)研究,并取得如下創(chuàng)新性研究成果:(1)系統(tǒng)研究了P.ananatis Sd-1降解水稻秸稈的特性。在以水稻秸稈為唯一碳源的培養(yǎng)基中,P.ananatis Sd-1在6天內(nèi)可以使水稻秸稈的總重量及其纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組分的含量分別減少62.7%、75.2%、78.8%和35.6%,產(chǎn)生的還原糖量可達(dá)0.1586 mg/ml。在降解過程中P.ananatis Sd-1分泌的內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、木聚糖酶、木質(zhì)素過氧化物酶和漆酶活性分別達(dá)到1.55U/ml、0.47 U/ml、25.29 U/ml、2.59 U/ml和0.61 U/ml。(2)測定和分析了P.ananatis Sd-1的全基因組序列,并建立其木質(zhì)纖維素降解相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫。全基因組測序和生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示,P.ananatis Sd-1全基因組大小為4,927,500 bp,GC含量為53.34%,共有4548個編碼序列,其中具有蛋白質(zhì)編碼功能的基因有4332個,65個tRNA編碼基因,9個核糖體RNA操縱子。通過與碳水化合物(CAZy)數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)P.ananatis Sd-1基因組中含有154個編碼CAZy的基因,其中包括59個糖苷水解酶(GHs)編碼基因、25個碳水化合物酯酶(CEs)編碼基因、2個多糖裂解酶(PLs)編碼基因、9個輔助酶(AAs)編碼基因和11個碳水化合物結(jié)合組件(CBMs)編碼基因。其纖維素酶、半纖維素酶及部分木質(zhì)素酶編碼基因均包含在這些CAZy中。將P.ananatis Sd-1的CAZy基因與相同種屬的其他P.ananatis細(xì)菌及已報道的木質(zhì)素、纖維素降解細(xì)菌比較,發(fā)現(xiàn)p.ananatissd-1的cazy基因數(shù)量最多,其中尤以ces與aas的基因數(shù)目遠(yuǎn)高于相比較的其他細(xì)菌。此外,還發(fā)現(xiàn)大量與木質(zhì)素降解相關(guān)基因,包括多銅氧化酶、過氧化氫酶、醌氧化還原酶和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶等編碼基因。醌氧化還原酶基因、gmc家族氧化還原酶基因以及具有β-酯酶活性谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因的存在分別表明芬頓化學(xué)途徑和和β-芳基醚降解途徑有可能存在于p.ananatissd-1降解木質(zhì)纖維素過程中。(3)從轉(zhuǎn)錄水平、酶活性和蛋白質(zhì)組學(xué)層次對p.ananatissd-1的木質(zhì)纖維素降解酶系進(jìn)行了解析。在以水稻秸稈為碳源的培養(yǎng)基中,p.ananatissd-1的木質(zhì)纖維素降解酶基因表達(dá)量均顯著高于其在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中的水平(至少p0.05)。與之對應(yīng),水稻秸稈培養(yǎng)基中測定的內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶、木質(zhì)素過氧化物酶和漆酶活性均高于葡萄糖培養(yǎng)基中的活性。采用nanolc-ms/ms技術(shù)分析了p.ananatissd-1的分泌蛋白質(zhì)組,從水稻秸稈培養(yǎng)基和葡萄糖培養(yǎng)基中分別鑒定出了108個和52個蛋白質(zhì),其中與木質(zhì)纖維素降解直接相關(guān)的蛋白質(zhì)數(shù)目分別為15和3。由此可見,p.ananatissd-1中的木質(zhì)纖維素降解相關(guān)酶,其活性是受底物所誘導(dǎo)調(diào)控。(4)分析并驗證了p.ananatissd-1降解木質(zhì)纖維素過程中存在依賴芬頓反應(yīng)(fe2++h2o2+h+→fe3++?oh+h2o)的非酶氧化體系。p.ananatissd-1可以降解未預(yù)處理的水稻秸稈,其處理3天后,水稻秸稈及其纖維素、半纖維和木質(zhì)素組分的降解率分別達(dá)到46.7%、43.1%、42.9%和37.9%。而在分別加入二甲基亞砜(dmso)、甘露醇、硫脲和乙醇等羥基自由基清除劑后,可顯著降低水稻秸稈降解率(p0.001),可見其降解途徑是羥基自由基依賴型。通過熱裂解-氣質(zhì)聯(lián)用和紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)p.ananatissd-1與芬頓試劑處理后的水稻秸稈成分化學(xué)結(jié)構(gòu)變化類似。進(jìn)一步研究芬頓反應(yīng)的兩大要素,即fe3+還原活性和過氧化氫的產(chǎn)生,發(fā)現(xiàn)p.ananatissd-1在水稻秸稈培養(yǎng)基中生長時所產(chǎn)的fe3+還原活性顯著高于其在葡萄糖培養(yǎng)基中的fe3+還原活性。氣質(zhì)聯(lián)用儀分析結(jié)果顯示p.ananatissd-1在水稻秸稈培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物中,含酚羥基的芳香化合物的fe3+還原活性顯著高于其分泌蛋白質(zhì)的fe3+還原活性。同時,基因轉(zhuǎn)錄水平和酶活檢測發(fā)現(xiàn),p.ananatissd-1中與過氧化氫產(chǎn)生有關(guān)的gmc家族氧化還原酶基因表達(dá)量和酶活性,在水稻秸稈培養(yǎng)基中均高于葡萄糖培養(yǎng)基,在秸稈粉末培養(yǎng)基中檢測出過氧化氫濃度卻低于葡萄糖培養(yǎng)基。綜合上述數(shù)據(jù)均證明非酶氧化體系即芬頓化學(xué)途徑很可能存在于p.ananatissd-1的木質(zhì)纖維素降解系統(tǒng)中�？傊�,P.ananatis Sd-1木質(zhì)纖維素降解體系包含木質(zhì)纖維素降解酶水解體系和依賴芬頓反應(yīng)的非酶氧化體系兩大類,其降解機(jī)理很可能是初期通過芬頓反應(yīng)產(chǎn)生的羥基自由基氧化破壞木質(zhì)纖維素的完整結(jié)構(gòu),隨后其分泌的一系列木質(zhì)纖維素降解酶類能進(jìn)入內(nèi)部與相應(yīng)的底物接觸作用,從而降解木質(zhì)纖維素。本論文的研究結(jié)果為目前尚未明確的細(xì)菌木質(zhì)纖維素降解機(jī)制的闡明提供了更充分的科學(xué)依據(jù),具有重要的科學(xué)價值。同時,也為P.ananatis Sd-1應(yīng)用于木質(zhì)纖維素原料的生物質(zhì)轉(zhuǎn)化奠定了理論基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q939.9

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本文編號：1263733