本文關鍵詞：HeLa細胞周期中核仁超微結構改組重構行為與rDNA分布和轉錄的動態(tài)變化研究

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【摘要】：核仁是間期細胞核中最顯著的結構,是核糖體RNA基因轉錄和轉錄產物進一步加工成熟的場所。核仁三個主要特征區(qū)域由纖維中心(fibrillar center,FC)結構區(qū)域和致密纖維組分結構區(qū)域(dense fibrillar component,DFC)以及顆粒區(qū)結構區(qū)域(granular component,GC)組成。在細胞周期進程中核仁發(fā)生規(guī)律的解體、消失和重建的過程,這種高度動態(tài)變化的特點使核仁超微結構及其功能的研究進展緩慢,也是存在諸多爭論分歧的重要原因之一。爭論的主要焦點是核仁中核糖體基因(r DNA)分布以及轉錄位點、轉錄后形成r RNA前體的剪切位點等在哪個具體的區(qū)域?過去的大多數研究者只是針對細胞周期中某個時期的細胞核仁進行相關的研究,卻忽視了核仁細胞分裂間期也是一個相對的動態(tài)結果,核仁內部結構組分及其物質是跟隨著G1期、S期、G2期進程而發(fā)生變化,因此r DNA分布、轉錄和剪切位點也應是動態(tài)變化的。本文采用胸腺嘧啶核苷雙阻斷法對HeLa細胞進行同步化培養(yǎng),PCNA免疫抗體標記、吖啶橙特異性染色法以及常規(guī)電子顯微鏡超薄切片技術結合NAMA-Ur特異性方法、Bernhard染色法等對HeLa細胞核仁在細胞周期不同時段的超微結構變化以及核仁中r DNA分布和轉錄位點進行研究,主要結果如下:1.HeLa細胞核仁FC和DFC在細胞周期進程中不同時段的動態(tài)變化:在早G1期的小核仁中FC和DFC的體積都較小,界限模糊,到晚G1期時段核仁體積變大,形成較大FC和DFC。早S期FC和DFC經典構型發(fā)生改變,中S期FC和DFC結構消失,核仁內呈現勻質結構,晚S期時,較小的FC結構重新出現,數量較多。G2期,大型FC和DFC與數量眾多的小FC和DFC并存于核仁中。2.通過NAMA-Ur方法對r DNA進行特異性染色,結果顯示r DNA組分在細胞周期進程中分布位置和形態(tài)隨著不同時期而改變:早G1期以染色質纖維的形式分布在FC內部或邊緣;晚G1期、早S期、晚S期和G2期的FC區(qū)域分布致密的染色質塊和DFC區(qū)域周圍松散的DNA纖維組分;中S期DNA組分兩種形態(tài)分布:一種是FC區(qū)域染色較淺的團塊狀DNA組分,一種是在勻質結構中的致密的顆粒狀DNA組分�？梢奃NA組分分布范圍隨著細胞周期進程的不同時段而改變。3.通過Bernhard染色對核仁RNA進行優(yōu)先染色,結果顯示HeLa細胞核仁r RNA轉錄位點標記出現在FC和DFC交界處以及DFC區(qū)域,在細胞間期不同時段的核仁中,結果也不盡相同:在G1期,核仁FC邊緣少量染色較淺的RNA組分。在早S期,FC區(qū)域邊緣有較少的RNA組分。在中S期,勻質結構內的RNA組分呈致密的纖維條索狀相互連接。晚S期,FC邊緣含有致密的RNA顆粒組分。在G2期,主要在DFC區(qū)域及其與FC交界有致密的“半月形”RNA組分結構,說明此時轉錄生成r RNA初始產物的速度最高,活躍度最強。4.采用吖啶橙特異性染色HeLa細胞核仁DNA和RNA,結果顯示早G1期,較強的DNA綠色熒光分布核膜處,RNA橙色熒光主要分布在細胞質。晚G1期和S期,DNA綠色熒光主要分布核仁及其核仁周邊,RNA橙色熒光主要分布在核仁。在G2期,RNA橙色熒光信號最強,說明在G2期RNA轉錄活躍程度最強。5.采用B23蛋白免疫抗體標記在光鏡下觀察細胞周期不同時段的熒光信號強度變化,觀察結果提示,在G1期、S期和G2期時段B23蛋白一直存在,特別是在G2期B23蛋白標記熒光信號最強,在分裂期細胞核仁內幾乎觀察不到明顯的B23蛋白熒光信號,說明在核仁中存在著活躍狀態(tài)和儲存狀態(tài)兩種不同形式。綜上所述,在HeLa細胞核仁結構中FC和DFC數目和形態(tài)在細胞分裂間期過程中同樣是高度動態(tài)變化的,特別是在中S期時段核仁FC和DFC發(fā)生了改組與重構的形態(tài)學變化,這是我們的新發(fā)現。在細胞間期中核仁FC和DFC區(qū)域的r DNA組分也是動態(tài)變化的。提示核仁r RNA轉錄、前體剪切的活動狀態(tài)和位點隨著細胞間期的G1、S、G2期進程而不斷變化。本實驗觀察結果為進一步闡明真核生物細胞核仁在細胞周期進程中超微結構與r RNA轉錄、剪切之間的關系提供和完善了更多的實驗依據和數據基礎。
【學位授予單位】：東北師范大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：Q243

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本文編號：1262444