發(fā)布時(shí)間：2017-12-07 09:29

  本文關(guān)鍵詞：八角內(nèi)生真菌的分離及其生物轉(zhuǎn)化苯類香料的研究

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【摘要】：八角是廣西的特色香料植物,其被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。本文從八角果、葉、枝等部位分離純化八角內(nèi)生真菌,對(duì)反式茴腦、肉桂醛以及苯乙酮等苯類香料進(jìn)行了生物轉(zhuǎn)化研究,主要研究內(nèi)容和成果如下:1.八角內(nèi)生真菌的分離、反式茴腦轉(zhuǎn)化活性菌株的篩選和鑒定采用組織貼片平板培養(yǎng)的方法,從八角果、枝、葉中各分離獲得24、32和23共79株內(nèi)生真菌。利用微生物細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化方法,經(jīng)底物耐受試驗(yàn)、TLC分析和HPLC分析,從79株內(nèi)生真菌中篩選得到BGEF13和BJEF32,兩菌株轉(zhuǎn)化反式茴腦得到的產(chǎn)物分別為茴香醇和異香蘭酸,形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明,BGEF13歸屬為稻黑孢菌Nigrospora oryzae,BJEF32 為可可毛色二孢菌Lasiodiplodiapseudotheobromae。2.八角內(nèi)生真菌L.pseudotheobromae BJEF32轉(zhuǎn)化反式茴腦合成異香蘭酸采用單因素試驗(yàn)方法考察了轉(zhuǎn)化條件和細(xì)胞培養(yǎng)條件對(duì)八角內(nèi)生真菌L.pseudotheobromae BJEF32轉(zhuǎn)化反式茴腦合成異香蘭酸的影響。適宜的轉(zhuǎn)化條件為:以0.05 mol·L-1 pH 7.0的Na2HP04-KH2P04緩沖溶液為反應(yīng)介質(zhì),在100 mL三角瓶中,裝液量為20 mL,菌體細(xì)胞濃度為50 g·L-1,底物反式茴腦濃度為1.48 g·L-1,輔助底物葡萄糖濃度為10 g·L-1,置于搖床中150 rpm、30℃轉(zhuǎn)化48 h;適宜的細(xì)胞培養(yǎng)條件為:液體培養(yǎng)基中馬鈴薯濃度為250 g·L-1、葡萄糖濃度為20g·L-1、反式茴腦濃度為0.1 g·L-1,初始pH 7.0,裝液量為100mL/250mL三角瓶,接種量為cφ6mm菌餅10個(gè),接種后于28℃、150 rpm搖床培養(yǎng)96 h。在上述條件下,異香蘭酸的產(chǎn)率為62%,轉(zhuǎn)化液中異香蘭酸的濃度達(dá)1.03 g·L-1。酶學(xué)實(shí)驗(yàn)和中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,八角內(nèi)生真菌L.pseudotheobromae BJEF32轉(zhuǎn)化反式茴腦合成異香蘭酸的可能途徑為:反式茴腦→反式茴腦環(huán)氧化物→反式茴腦二醇→茴香醛/茴香醇→茴香酸→異香蘭酸。3.八角內(nèi)生真菌N.oryzae.BGEF13轉(zhuǎn)化反式茴腦合成茴香醇采用單因素試驗(yàn)方法優(yōu)化八角內(nèi)生真菌N.oryzae.BGEF13轉(zhuǎn)化反式茴腦合成茴香醇的條件,得到轉(zhuǎn)化條件為:以0.05 mo1·L-1 pH 6.0的Na2HP04-KH2P04緩沖溶液為反應(yīng)介質(zhì),在100mL三角瓶中,裝液量為40 mL,菌體細(xì)胞濃度為50 g·L-1,底物反式茴腦濃度為2.96 g·L-1,輔助底物葡萄糖濃度為10 g·L-1,置于搖床中120 rpm、30℃轉(zhuǎn)化24 h;適宜的細(xì)胞培養(yǎng)條件為:液體培養(yǎng)基中馬鈴薯濃度為200 g·L-1、葡萄糖濃度為20g·L-1、蛋白胨濃度為2 g·L-1、反式茴腦濃度為0.1 g·L-1,初始pH 6.5,裝液量為100 mL/250mL三角瓶,接種量為φ6mm菌餅10個(gè),接種后于28℃、120 rpm搖床轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)96 h。在優(yōu)化條件下,茴香醇的產(chǎn)率達(dá)42%左右,轉(zhuǎn)化液中茴香醇的濃度達(dá)1.16 g·L-1。酶學(xué)實(shí)驗(yàn)和中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,八角內(nèi)生真菌N.oryzae BGEF13轉(zhuǎn)化反式茴腦合成茴香醇的可能途徑為:反式茴腦→反式茴腦環(huán)氧化物→反式茴腦二醇→茴香醛→茴香醇/茴香酸。4.八角內(nèi)生真菌催化苯乙酮還原合成手性化合物R-(+)-1-苯乙醇從八角內(nèi)生真菌中篩選獲得一株新殼梭孢菌Neofusicoccum parvum BYEF07,它能催化苯乙酮高選擇性還原合成手性化合物1-苯乙醇,產(chǎn)物以R-(+)-1-苯乙醇為主。轉(zhuǎn)化適宜條件為:以0.05 g·L-1 pH 7.5的Na2HP04-KH2P04緩沖溶液為反應(yīng)介質(zhì),在100mL三角瓶中,裝液量為40 mL,底物苯乙酮的濃度為1.8 g·L-1、菌體濃度為100 g·L-1、輔助底物葡萄糖濃度為10g·L-1、裝液量為40ml/100mL三角瓶、搖床轉(zhuǎn)速150rpm、反應(yīng)溫度為30℃、反應(yīng)時(shí)間為48 h;細(xì)胞培養(yǎng)的適宜條件為:液體培養(yǎng)基中馬鈴薯濃度為250g·L-1、蔗糖濃度為20g·L-1、初始pH7.5、裝液量為100 mL/250mL三角瓶、接種量為φ6mm菌餅12個(gè),接種后于28℃、120rpm搖床培養(yǎng)120 h。在上述條件下,1-苯乙醇的摩爾轉(zhuǎn)化產(chǎn)率達(dá)85%,轉(zhuǎn)化液中1-苯乙醇的濃度達(dá)1.55·L-1,R-(+)構(gòu)型的ee值可達(dá)99%。八角內(nèi)生真菌N.parvum BYEF07細(xì)胞催化苯乙酮不對(duì)稱還原生成1-苯乙醇的過程中存在底物抑制和產(chǎn)物抑制效應(yīng)。采用Han-Levenspiel模型擬合得底物抑制反應(yīng)模型中的各參數(shù)為:Vsm=0.082mmol·L-1·g-1·h-1,Ks=4.24 mmol·L-1,Sc=95 mmol·L-1 n=1.45;產(chǎn)物抑制反應(yīng)模型中的各參數(shù)為:Vpm=0.051 mmol·L-1·g-1·h-1,Pc= 146 mmol·L-1,m=1.28。5.八角內(nèi)生真菌催化肉桂醛加氫合成肉桂醇和3-苯丙醇從八角內(nèi)生真菌中篩選得到塔賓曲霉Aspergillustubingensis BGEF03和葡萄座腔菌Botryosphaeriadothidea BGEF10,它們能選擇性催化肉桂醛加氫生成肉桂醇和3-苯丙醇。AspergillustubingensisBGEF03轉(zhuǎn)化肉桂醛合成肉桂醇的適宜反應(yīng)條件為:以0.05 mol·L-1 pH 6.5的Na2HP04-KH2P04緩沖溶液作為反應(yīng)介質(zhì),在100 mL三角瓶中的裝液量為40 mL,底物濃度為1.5 g·L-1,菌體細(xì)胞濃度為50g·L-1 輔助底物葡萄糖濃度為10g·L-1搖床轉(zhuǎn)速120rpm、25℃下轉(zhuǎn)化24 h。在此條件下,肉桂醇的產(chǎn)率達(dá)58.5%,轉(zhuǎn)化液中肉桂醇的濃度可達(dá)0.89 g·L-1,體系中未檢測(cè)到3-苯丙醇。BotryosphaeriadothideaBGEF10催化肉桂醇加氫合成3-苯丙醇的適宜條件為:以0.05 mol·L-1 pH 7.0的Na2HP04-KH2P04緩沖溶液為反應(yīng)介質(zhì),在100 mL三角瓶中裝液量為40 mL,菌體細(xì)胞濃度為75 g·L-1,底物濃度為1.0 g·L-1,葡萄糖濃度為15 g·L-1,搖床轉(zhuǎn)速150 rpm,溫度30℃下轉(zhuǎn)化72h。在此條件下,3-苯丙醇的產(chǎn)率達(dá)78.9%,而肉桂醇的產(chǎn)率僅為5.4%,反應(yīng)體系中3-苯丙醇和肉桂醇的最終濃度分別為0.81 g·L-1和0.06 g·L-1。
【學(xué)位授予單位】：廣西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q93;TQ651
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本文編號(hào)：1261930