本文關(guān)鍵詞：駱駝刺中慢生根瘤菌CCNWXJ12-2~T鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組分析及與耐鹽相關(guān)基因功能研究

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【摘要】：駱駝刺中慢生根瘤菌Mesorhizobium alhagi CCNWXJ12-2~T是本實(shí)驗(yàn)室從新疆荒漠地區(qū)疏葉駱駝刺根瘤中分離得到的具有優(yōu)良抗逆性的菌株,最高能夠耐受0.8 M NaCl。為了更好的研究其耐鹽機(jī)制,本文使用RNA-Seq技術(shù),研究其在不同鹽濃度條件下轉(zhuǎn)錄組表達(dá)差異,然后選取部分差異表達(dá)基因,利用同源重組技術(shù)構(gòu)建基因敲除突變體,對(duì)突變體表型進(jìn)行檢測(cè),以進(jìn)一步研究基因功能。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示,以2倍為篩選差異表達(dá)基因的閾值,在高鹽條件下,差異表達(dá)基因總數(shù)為1849個(gè),占總注釋基因數(shù)(7195)的25.7%。其中933個(gè)基因表達(dá)下調(diào),916個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。表達(dá)上調(diào)基因主要集中在氨基酸合成及轉(zhuǎn)運(yùn)、碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝、能量代謝、核糖體合成、蛋白質(zhì)翻譯等代謝過(guò)程,說(shuō)明在高鹽條件下,M.alhagi XJ12-2~T的能量代謝水平和蛋白合成能力都有所提高。同時(shí),大部分與抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)有不同程度的升高,說(shuō)明在高鹽條件下,該菌的抗氧化能力有一定程度的提高。下調(diào)基因主要富集在膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)代謝通路,該菌中幾種常見(jiàn)的蛋白分泌系統(tǒng),如第二套三型分泌系統(tǒng)(T3SS2)、四型分泌系統(tǒng)(T4SS)、六型分泌系統(tǒng)(T6SS)等的表達(dá)都有所下調(diào)。同時(shí),在高鹽條件下,大部分分子伴侶基因的表達(dá)量也有所降低。在1894個(gè)差異表達(dá)基因中,有653個(gè)基因被注釋為假定蛋白,占差異基因總數(shù)的35.32%,說(shuō)明在該菌的耐鹽機(jī)制中,仍有許多未知的部分。綜上所述,M.alhagi XJ12-2~T對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)是一個(gè)復(fù)雜而又系統(tǒng)的過(guò)程,涉及大部分細(xì)胞代謝。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn),在高鹽條件下,M.alhagi XJ12-2~T有兩套與甘氨酸甜菜堿/脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的proVWX操縱子的表達(dá)量顯著上調(diào)。甘氨酸甜菜堿/脯氨酸作為常見(jiàn)的滲透保護(hù)物,廣泛存在于微生物及植物中。本研究利用同源重組技術(shù),構(gòu)建這兩套甘氨酸甜菜堿/脯氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的敲除突變體XJG1和XJG2,并對(duì)突變體的耐鹽及抗氧化能力進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明兩個(gè)突變體的鹽耐受能力及抗氧化能力與野生型相比沒(méi)有明顯改變。這種情況有可能是由于該系統(tǒng)在M.alhagi XJ12-2~T中存在冗余所造成的,也可能是因?yàn)樵摼軌驈钠渌镔|(zhì)(如膽堿)合成甘氨酸甜菜堿/脯氨酸,從而抵消proVWX敲除所造成的影響。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示,在高鹽條件下第一套三型分泌系統(tǒng)(T3SS1)的表達(dá)顯著上調(diào),表明該系統(tǒng)有可能與M.alhagi XJ12-2~T的耐鹽能力有關(guān)。于是本研究利用同源重組技術(shù),構(gòu)建ΔrhcQ,Δ0070及ΔT3三個(gè)基因敲除突變體來(lái)研究T3SS1在M.alhagi XJ12-2~T抗環(huán)境脅迫中的作用,其中rhcQ基因編碼結(jié)構(gòu)蛋白,0070編碼假定的分泌蛋白,ΔT3為包括rhcQ在內(nèi)的9個(gè)基因的敲除突變體。結(jié)果表明突變體ΔrhcQ和ΔT3的耐鹽能力和抗氧化能力與野生型相比有明顯的降低;突變體Δ0070與野生型相比,只對(duì)KCl的耐受能力有明顯降低,對(duì)其他鹽的耐受能力及抗氧化能力則沒(méi)有明顯的變化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),三株突變體在高鹽條件下細(xì)胞總鈉離子和鉀離子的含量要高于野生型,而且其抗氧化酶活力明顯低于野生型,說(shuō)明T3SS1對(duì)M.alhagi XJ12-2~T維持細(xì)胞內(nèi)的離子穩(wěn)態(tài)和抗氧化能力有一定的作用。在下調(diào)基因中,選取絲氨酸蛋白激酶基因(prkA)進(jìn)行研究。絲氨酸蛋白激酶在微生物中廣泛存在并且比較保守,在不同的微生物中發(fā)揮著不同的功能。利用同源重組技術(shù),構(gòu)建prkA基因敲除突變體,并對(duì)突變體的抗逆特性進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,prkA基因的敲除,使菌株的鹽耐受能力和抗氧化能力有了明顯的提高。對(duì)細(xì)胞總Na+含量的測(cè)定結(jié)果顯示,突變體與野生型細(xì)胞總Na+含量基本一致,說(shuō)明prkA基因?qū)υ摼腘a+轉(zhuǎn)運(yùn)沒(méi)有影響。而對(duì)抗氧化酶活力測(cè)定結(jié)果表明,突變體抗氧化酶活力與野生型相比有明顯的提高,表明prkA基因能夠通過(guò)影響M.alhagi XJ12-2~T中抗氧化酶活力來(lái)影響其耐鹽能力。
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：Q939.114;Q78

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1 柳曉東;駱駝刺中慢生根瘤菌CCNWXJ12-2~T鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組分析及與耐鹽相關(guān)基因功能研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

2 周美麗;駱駝刺中慢生根瘤菌CCNWXJ12-2~T全基因組測(cè)序及耐鹽相關(guān)功能基因的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2014年

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本文編號(hào)：1261447