本文關(guān)鍵詞：里氏木霉纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Xyr1功能研究及銅離子響應(yīng)高效表達(dá)體系的建立

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【摘要】：纖維素是目前地球上含量最為豐富的碳水化合物之一,是植物以及藻類細(xì)胞壁的重要組成部分,每年通過光合作用大約產(chǎn)生1.5-1.7×1011噸的纖維素,纖維素的合成及降解構(gòu)成了地球碳循環(huán)的重要組成部分。另一方面,隨著人們對(duì)化石燃料的不斷開采,煤炭、石油等資源瀕臨枯竭,充分利用自然界中大量存在的可再生生物質(zhì)進(jìn)行生物燃料轉(zhuǎn)化成為目前研究的一個(gè)熱點(diǎn)。絲狀真菌是目前工業(yè)纖維素酶生產(chǎn)的主要菌株,其中里氏木霉(Trichoderma reesei)是其中典型代表,其能夠向胞外分泌大量的纖維素外切酶、內(nèi)切酶以及葡萄糖苷酶三種類型的纖維素酶,酶量可占胞外蛋白總分泌量的60%以上。里氏木霉一個(gè)重要的生理學(xué)特性就是只有當(dāng)胞外存在纖維素、乳糖及槐糖等誘導(dǎo)物時(shí),纖維素酶才被大量誘導(dǎo)表達(dá)；而在葡萄糖培養(yǎng)條件下,其表達(dá)完全被抑制。里氏木霉這一高效誘導(dǎo)產(chǎn)酶特性一直被大家廣泛關(guān)注,但其中的具體調(diào)控機(jī)制尚未被完全解釋清楚。在一系列參與纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子中,Xyrl是纖維素酶基因誘導(dǎo)表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄激活因子。當(dāng)Xyrl缺失時(shí),除了bgl2外基本所有的纖維素酶及半纖維素酶基因均不發(fā)生轉(zhuǎn)錄,但其具體的轉(zhuǎn)錄激活機(jī)制尚不清楚。因此,對(duì)Xyr1功能的深入研究將為深入闡述里氏木霉纖維素酶基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制,全面闡述纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定理論基礎(chǔ)；同時(shí)也將為理性遺傳改造工業(yè)生產(chǎn)菌株,提高纖維素酶的表達(dá)水平提供相應(yīng)的理論指導(dǎo)。論文圍繞分析Xyr1的功能展開,主要研究內(nèi)容與研究結(jié)果如下：1.里氏木霉纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄因子Xyrl的相關(guān)結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)功能分析。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),里氏木霉纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Xyrl與酵母半乳糖苷酶轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Gal4結(jié)構(gòu)類似,屬于真菌特異的鋅指雙核結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)Xyrl及其同源物在黑曲霉,構(gòu)巢曲霉,粗糙脈孢霉等絲狀真菌中普遍存在。根據(jù)Ga14的結(jié)構(gòu)域特征,我們將Xyr1分為DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD),中間同源(Middle Homology Region, MHR)及轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(Activating domain, AD)三個(gè)結(jié)構(gòu)域。凝膠泳動(dòng)遷移技術(shù)(Electrophoresis Mobility Shift Assay, EMSA)以及酵母單雜交分析,Xyrl DBD區(qū)域與cbhl啟動(dòng)子多個(gè)區(qū)域均能進(jìn)行相互作用,其中對(duì)cbh1啟動(dòng)子的-800及-200區(qū)域有較強(qiáng)的結(jié)合能力。對(duì)XYR1潛在的磷酸化修飾位點(diǎn)突變之后,其DNA結(jié)合能力有所下降,且體內(nèi)轉(zhuǎn)錄激活能力出現(xiàn)下降。此外,等電點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn),Xyr1AD區(qū)域與Ga14AD區(qū)域存在明顯的不同,Xyr1AD區(qū)域并不以絕對(duì)的酸性區(qū)域存在,而是以酸性區(qū)-疏水區(qū)-堿性區(qū)這種類型的形式呈現(xiàn),而目前轉(zhuǎn)錄激活域的酸性性質(zhì)被認(rèn)為是特定轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。酵母雙雜交結(jié)果進(jìn)一步表明,Xyr1AD區(qū)域與Xyr1 MHR區(qū)域存在可能的相互作用。進(jìn)一步通過在Δxyrl菌株中構(gòu)建一系列Xyr1突變體,并對(duì)其活性功能進(jìn)行體內(nèi)分析研究,從而確定Xyr1不同結(jié)構(gòu)域在纖維素酶基因激活表達(dá)中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Xyr1 DBD的單獨(dú)表達(dá)并不能不能與cbh1啟動(dòng)子進(jìn)行有效的結(jié)合。單獨(dú)表達(dá)缺失了Xyr1 DBD的MHR-A D區(qū)域突變體時(shí)其在葡萄糖上定位于細(xì)胞質(zhì)中,在葡萄糖耗盡及纖維素誘導(dǎo)條件下均定位于液泡中,而在MHR缺失突變體中沒有相應(yīng)的表達(dá)熒光信號(hào),因此推斷Xyr1MH R區(qū)域?qū)τ诰S持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性具有非常關(guān)鍵的作用。當(dāng)單獨(dú)表達(dá)缺失了AD的Xyr1時(shí),其表達(dá)水平雖較低,但仍能夠微弱的激活纖維酶基因的轉(zhuǎn)錄,而當(dāng)將AD最后的堿性區(qū)片段缺失突變之后,突變體不再表達(dá)纖維酶,且不能激活轉(zhuǎn)錄。當(dāng)AD區(qū)域置換為全部酸性的Ga14AD之后,轉(zhuǎn)錄激活能力很低。因此Xyr1的AD可能在維持蛋白整體穩(wěn)定性方面比介導(dǎo)激活纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄更為重要。2.基于銅離子透性酶基因啟動(dòng)子Ptcu1的表達(dá)體系構(gòu)建為了進(jìn)一步明確Xyr1表達(dá)水平對(duì)纖維素酶基因表達(dá)的激活效應(yīng),分別利用gpd啟動(dòng)子及自身啟動(dòng)子在Δxyr1菌株中表達(dá)gfp-xyr1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在葡萄糖培養(yǎng)條件下,Pgpd-gfp-xyrl菌株有比較明顯的熒光信號(hào),且在培養(yǎng)后期發(fā)酵液中檢測到CBH1的分泌；將其進(jìn)一步在乳糖及Avicel表達(dá)時(shí),沒有非常明顯的熒光信號(hào),發(fā)現(xiàn)在纖維素為碳源進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)CBH1的分泌量要低于QM9414野生型菌株,同時(shí)菌株沒有明顯的熒光信號(hào)。表明gpd啟動(dòng)子強(qiáng)烈地受到環(huán)境中碳源的影響,為尋找一個(gè)不依賴于碳源且能夠介導(dǎo)目標(biāo)基因高水平表達(dá)的啟動(dòng)子,我們通過序列比對(duì)在里氏木霉基因組中鑒定到銅離子透性酶基因tcu1 (Tr52315)。利用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)其轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn),tcu1無論在葡萄糖、甘油及纖維素為碳源的培養(yǎng)條件下均能夠高水平表達(dá)。這種表達(dá)受銅離子抑制,tcu1的轉(zhuǎn)錄水平隨銅離子濃度的增加而降低,且外源銅離子的添加可迅速關(guān)閉tcul的轉(zhuǎn)錄的,而銅離子螯合劑BCS可部分恢復(fù)被銅離子抑制的tcul轉(zhuǎn)錄。為了進(jìn)一步研究此啟動(dòng)子對(duì)其它基因的調(diào)控能力,利用Ptcul表達(dá)gfp報(bào)告基因,通過熒光觀察銅離子能夠調(diào)控GFP的表達(dá)；Ptcul同樣可以驅(qū)動(dòng)cbhl及eg1的高水平表達(dá)且對(duì)外源銅離子特異響應(yīng)。另一方面,利用Ptcul對(duì)內(nèi)源性啟動(dòng)子置換試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)可以利用銅離子啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的可控性表達(dá)及抑制,從而為通過條件性缺失或轉(zhuǎn)錄下調(diào)來研究某些必需基因功能奠定了基礎(chǔ)。3.高水平Xyrl介導(dǎo)纖維素酶的組成型表達(dá)及Crel對(duì)纖維素酶調(diào)控模式初探細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn),Xyr1在誘導(dǎo)與非誘導(dǎo)條件下均定位于細(xì)胞核中。在Axyrl菌株基礎(chǔ)上構(gòu)建獲得了利用銅離子透性酶基因啟動(dòng)子Ptcul介導(dǎo)Xyrl過表達(dá)的重組菌株P(guān)tcu1-xyrI。結(jié)果表明,Ptcu1-x yr1菌株在葡萄糖或甘油非誘導(dǎo)碳源上不僅解除了碳代謝阻遏,而且胞外纖維素酶活與親本菌QM9414在纖維素誘導(dǎo)下的酶活相當(dāng)。Ptcu1-xyr1這種在非誘導(dǎo)條件下全面表達(dá)纖維素酶的能力與Xyrl的表達(dá)水平呈正相關(guān)。雖然Ptcu1-xyr1菌株在Avicel誘導(dǎo)下酶活沒有進(jìn)一步提升,但其在乳糖誘導(dǎo)下酶活出現(xiàn)了大幅度的提升。結(jié)果表明xyrl過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致菌株對(duì)壓力響應(yīng)更為敏感。染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果表明,xyr1過表達(dá)菌株無論在誘導(dǎo)與非誘導(dǎo)條件下,Xyrl與cbhl啟動(dòng)子的結(jié)合效率要比QM9414在Avicel在誘導(dǎo)條件下高20-30倍。通過染色質(zhì)可及性分析,Xyrl過表達(dá)菌株中cbhl啟動(dòng)子的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)相對(duì)于QM9414更為開放。由此可以推測Xyr1對(duì)纖維素酶基因啟動(dòng)子的高效結(jié)合,從而導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)更為開放是Xyr1過表達(dá)菌株纖維素酶高水平表達(dá)的一個(gè)主要因素。在纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中,Cre1是主要的轉(zhuǎn)錄抑制因子,在碳代謝阻遏中發(fā)揮著重要的作用。通過分析Cre1對(duì)于Xyrl調(diào)控方式研究,發(fā)現(xiàn)Cre1能夠在體內(nèi)及體外均可以結(jié)合xyr1基因啟動(dòng)子。ChIP分析Cre1在體內(nèi)與cbhl啟動(dòng)子并沒有明顯的結(jié)合。在Ptcu1-gfp-xyr1菌株中利用Ptcul啟動(dòng)子置換crel啟動(dòng)子,分析重組菌株的誘導(dǎo)特異特征時(shí)發(fā)現(xiàn),與單獨(dú)過表達(dá)Crel菌株不同,在Xyrl過表達(dá)的條件下,Crel的過表達(dá)對(duì)纖維素酶表達(dá)并未產(chǎn)生影響。推測Crel可能是通過調(diào)控xyr1的轉(zhuǎn)錄間接來調(diào)控纖維素酶基因表達(dá)。4.與Xyrl相關(guān)的其他纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的分析研究Xyrl在纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄激活過程中,同樣會(huì)有其它相關(guān)因子與之相互作用,共同調(diào)控纖維素酶基因的表達(dá)。為了尋找這些相關(guān)蛋白,利用酵母雙雜交文庫篩選我們得到與Xyr1AD相互作用蛋白Tr30478的羧基端部分,檢測分析其同樣也可以與Xyr1MHR進(jìn)行相互作用,通過敲除與過表達(dá)分析Tr30478對(duì)纖維素酶基因的表達(dá)發(fā)揮抑制作用,通過熒光定位分析其定位于細(xì)胞質(zhì)中。利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn),Tr30478 C-端部分也與Xyr1MH R區(qū)域具有相互作用,我們推測其可能在細(xì)胞質(zhì)通過調(diào)控Xyr1MHR與AD的相互作用發(fā)揮功能。在纖維素酶基因誘導(dǎo)表達(dá)過程中,Xyr1同樣發(fā)生轉(zhuǎn)錄上調(diào)。為了研究哪些轉(zhuǎn)錄因子參與Xyr1自身的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。利用酵母單雜交文庫篩選我們利用xyr1啟動(dòng)子篩選得到了三個(gè)與其相互作用的蛋白,包括兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子及一個(gè)磷酸激酶Sch9,這三個(gè)蛋白可能會(huì)通過調(diào)控xyr1的轉(zhuǎn)錄來調(diào)控纖維素酶基因的轉(zhuǎn)錄。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q933

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1241266