本文關鍵詞：深海沉積物細菌Pseudoaiteromonas sp.SM9913適應環(huán)境的生活方式及其生理與遺傳機制

  更多相關文章： 深海沉積物 底棲細菌 生活方式 胞外多糖 側生鞭毛 極生鞭毛 群涌運動 游動

【摘要】：在復雜的海洋生態(tài)系統(tǒng)中,異養(yǎng)細菌是溶解有機物和顆粒有機物的主要分解者,因此異養(yǎng)細菌在海洋生境的物質(zhì)循環(huán)和能量流動中起到了非常重要的作用。海洋沉積物中存在大量從上層海水沉積而來的顆粒有機物,底棲細菌作為這些顆粒有機物的主要分解者,是沉積物中物質(zhì)循環(huán)和能量流動的關鍵一環(huán)。研究底棲細菌的生活方式有助于了解其和海洋沉積物環(huán)境之間的相互作用,進而幫助我們理解底棲細菌對海洋沉積物環(huán)境的適應機制和其生態(tài)功能。但是,針對底棲細菌的生活方式的研究卻罕有報道。Pseudoalteromonas sp. SM9913 (Ps. sp. SM9913)是分離自沖繩海槽表層沉積物的一株典型深海沉積物異養(yǎng)細菌。在前期研究中,實驗室已經(jīng)對該菌株的胞外蛋白酶系、胞外多糖和基因組等進行了研究。在前期研究的基礎上,本文研究了Ps. sp. SM9913適應深海沉積物環(huán)境的生活方式。通過生理學、遺傳學和轉錄組學的研究,我們初步揭示了Ps. sp. SM9913的生活方式的相關機制,并提出了其可能的生活方式模型。(1)深海沉積物細菌Ps. sp. SM9913顆粒附著的生活方式及其遺傳機制在前期對Ps. sp. SM9913的胞外多糖的研究基礎上,我們推測其在深海沉積物環(huán)境中可能具有顆粒附著的生活方式。通過測定與黏土顆粒的結合能力,我們發(fā)現(xiàn)Ps. sp. SM9913具有與浮游細菌Pseudoalteromonas. haloplanktis TAC125 (Ps. haloplanktis TAC125)相近的黏土結合能力,表明其可能具有顆粒附著的生活方式。而胞外多糖合成缺陷株ΔepsT的黏土顆粒結合能力則顯著低于野生型,ΔepsT中基因epsT的回補表達能夠使其顆粒結合能力恢復至野生型水平。這表明了胞外多糖在Ps.sp. SM9913的顆粒附著的生活方式中的重要作用。(2)深海沉積物細菌Ps. sp. SM9913的游動和群涌運動的表征前期對Ps. sp. SM9913的比較基因組學的分析發(fā)現(xiàn)其具有兩套鞭毛系統(tǒng),一個有37個基因的基因簇被認為是其側生鞭毛基因簇,負責合成側生鞭毛。而另外兩個分別有34個和22個基因的基因簇被認為是其極生鞭毛系統(tǒng),負責合成極生鞭毛。為驗證基因組學分析的結果,我們首先檢測了Ps. sp. SM9913的運動能力,結果表明其具有群涌和游動兩種運動能力。我們利用倒置顯微鏡進一步對Ps. sp. SM9913的群涌菌落邊緣進行了原位觀察,發(fā)現(xiàn)其群涌菌落邊緣的細胞排列在一個單細胞層中,且細胞在此單細胞層中隨機運動,菌落之外的細胞則不能運動。這種群涌方式與之前報道的大腸桿菌和枯草芽苞桿菌的群涌方式不同。為確認Ps. sp. SM9913的游動和群涌運動的“運動器官”,我們利用原子力顯微鏡對Ps. sp. SM9913的游動狀態(tài)和群涌狀態(tài)的細胞進行了觀察,結果表明游動狀態(tài)的細胞具有單個短的極生鞭毛,而群涌狀態(tài)的細胞則具有多條側生鞭毛。這些結果驗證了前期的基因組學分析的結果,并第一次較為系統(tǒng)地表征了一株海洋細菌的游動和群涌運動。(3)深海沉積物細菌Ps. sp. SM9913的游動和群涌的遺傳基礎為進一步驗證側生鞭毛基因簇和極生鞭毛基因簇分別為Ps.sp. SM9913的群涌運動和游動的遺傳基礎。我們利用基因敲除技術對Ps. sp. SM9913的基因組中兩個鞭毛系統(tǒng)分別進行了破壞。在側生鞭毛基因簇中,敲除了基因PSM_A0914和PSM_A0915后得到了側生鞭毛缺失突變株△LF。運動性實驗表明△LF喪失了群涌運動能力。在突變株△LF中回補被敲除的基因PSM_A0914和PSM_A0915后,其恢復了群涌運動能力。在極生鞭毛基因簇中,敲除了基因PSM_A2283、PSM_A2282和PSM_A2281后得到了側生鞭毛缺失突變株△PF。運動性實驗表明△PF喪失了游動能力。在突變株△PF中回補被敲除的PSM_A2283、PSM_A2282和PSM_A2281后,其游動能力恢復到野生株的水平。在突變株△PF中敲除了基因PSM_A0914和PSM_A0915后得到了側生鞭毛和極生鞭毛都缺失的突變株APFALF。運動性實驗表明APFALF喪失了游動和群涌運動能力。在APFALF回補了被敲除的基因PSM_A0914、PSM_A0915、PSM_A2283、PSM_A2282和PSM_A2281后,其游動和群涌運動能力都恢復至野生型水平。這些研究結果證實了Ps. sp. SM9913的群涌運動和游動的遺傳基礎分別是側生鞭毛基因簇和極生鞭毛基因簇。(4)深海沉積物細菌Ps. sp. SM9913的游動和群涌運動的比較轉錄組學分析為進一步了解Ps.sp. SM9913的群涌運動與游動之間的相互聯(lián)系和區(qū)別及相關調(diào)控機制,我們分別對這兩種運動狀態(tài)下的細胞進行了轉錄組測序并比較了兩種狀態(tài)下基因的差異表達情況。比較結果表明,差異表達的基因中有946個是在群涌運動狀態(tài)中上調(diào)表達的,而在群涌運動狀態(tài)中下調(diào)表達的基因僅有76個。基因組分析預測的側生鞭毛基因簇中所有基因在群涌狀態(tài)中都是上調(diào)表達的,且我們發(fā)現(xiàn)側生鞭毛基因簇上下游共計3個基因也具有類似的上調(diào)表達。比對分析發(fā)現(xiàn)這3個基因也與鞭毛的合成組裝有關,由此我們對基因組分析預測的側生鞭毛基因簇作了進一步的補充完善。我們利用實時熒光定量PCR技術對轉錄組測序的結果進行了驗證。結果表明,選取的4個側生鞭毛基因簇中的基因皆是在群涌細胞中顯著上調(diào)表達的；而3個極生鞭毛基因簇中的基因則都是在群涌細胞中略微下調(diào)表達的。實時熒光定量PCR的結果證實了我們的轉錄組測序結果是可靠的。轉錄組比較分析發(fā)現(xiàn),編碼甲基化受體趨化性蛋白的基因21個中有18個是在群涌狀態(tài)的細胞中顯著上調(diào)表達的。其中上調(diào)表達最明顯的是基因PSM_A2360,其編碼的蛋白的同源蛋白Tsr在Escherichia coli中已被證實參與到群涌運動的信號傳遞中。這說明在Ps. sp. SM9913中可能存在類似的信號途徑。在Ps. sp. SM9913的群涌狀態(tài)的細胞中,大量與第二信使環(huán)二鳥苷酸單磷酸(c-di-GMP)的合成、降解、相互作用有關的蛋白的編碼基因顯著地上調(diào)表達。且在Ps. sp. SM9913的側生鞭毛基因簇中的基因PSM_A0906編碼的蛋白是一個長133個氨基酸僅具有一個PliZ單結構域的蛋白,而蛋白中的PliZ結構域已被證明是可以與c-di-GMP結合的。這些結果暗示第二信使c-di-GMP可能參與到了Ps. sp. SM9913的運動性的調(diào)控中。編碼三對雙組分調(diào)控系統(tǒng)元件的6個基因在群涌細胞中是顯著上調(diào)表達的,且這三對雙組分調(diào)控系統(tǒng)元件在Ps. sp. SM9913的相近種Ps. haloplanktis TAC125是沒有直系同源蛋白的。其中PSM_A0531和PSM_A0532組成的雙組分調(diào)控系統(tǒng)可能直接調(diào)控Ps. sp. SM9913的側生鞭毛基因簇的轉錄表達。第二對雙組分調(diào)控系統(tǒng)由PSM_A2131和PSM_A2132組成,可能通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)c-di-GMP的濃度參與到Ps. sp. SM9913的運動性調(diào)控中。PSM_B0075和PSM_B0076所組成的雙組分調(diào)控系統(tǒng)可能通過群體感應調(diào)控Ps. sp. SM9913的運動性。鐵載體受體蛋白和鐵載體轉運蛋白的編碼基因在群涌狀態(tài)的細胞中都顯著地上調(diào)表達,而與鐵儲存相關蛋白和一些含鐵蛋白的編碼基因則在群涌狀態(tài)的細胞中顯著地下調(diào)表達。測定結果表明,我們所用的液體海水培養(yǎng)基中鐵離子濃度為4.64±0.07μM。在群涌運動的培養(yǎng)中加入終濃度從1μM到10μM的FeCl3發(fā)現(xiàn)外源添加的FeCl3會抑制Ps. sp. SM9913的群涌運動,濃度越高的FeCl3抑制作用越明顯。生長曲線測定實驗表明在培養(yǎng)基中添加同樣濃度的FeCl3并不影響Ps. sp. SM9913的正常生長。這些結果表明,環(huán)境中鐵的缺乏可能會誘導Ps. sp. SM9913的群涌運動。比較轉錄組學的研究很好地補充了前期基因組學和遺傳學的研究,初步揭示了Ps.sp.SM9913的游動和群涌兩種運動方式的生理機制,為進一步詳細研究其運動性的調(diào)控機制奠定了基礎。(5)胞外多糖在Ps. sp. SM9913的群涌運動中的作用細菌菌落的粘液層對群涌運動有重要的作用,而胞外多糖是粘液層的主要組分之一。我們利用Ps. sp. SM9913的胞外多糖合成缺陷株ΔepsT研究了胞外多糖在其群涌運動中的作用。比較分析發(fā)現(xiàn)AepsT同樣具有群涌運動能力但其群涌菌落大小明顯小于野生型菌株,說明胞外多糖的缺失削弱了其群涌運動能力。定量分析Ps. sp. SM9913和ΔepsT的群涌運動菌落直徑發(fā)現(xiàn),野生型Ps. sp.SM9913的菌落擴張速度的變化趨勢是先增大后減小,呈倒鐘形。而突變株AepsT的菌落擴張速度在起初為最大,并呈逐漸減小的趨勢。Ps. sp. SM9913的群涌運動具有起初的延遲期且是密度依賴的。而ΔepsT的群涌運動不具有延遲期,且不是密度依賴的。在群涌運動的培養(yǎng)基上添加surfactin可以回補ΔepsT的運動缺陷,其群涌運動菌落可以恢復至野生型大小但是其菌落直徑的變化趨勢與野生型有較明顯的差異。而添加Ps. sp. SM9913所分泌的胞外多糖能夠部分回補其群涌運動缺陷。這些結果表明胞外多糖在Ps. sp. SM9913的群涌運動具有一定的調(diào)控作用,能幫助我們理解胞外多糖在其生活方式中的意義。(6) Ps. sp. SM9913在深海沉積物中運動生活方式的模擬研究我們進一步用黏土模擬深海沉積物環(huán)境,分析了Ps. sp. SM9913及其突變株在黏土中的運動能力,并與浮游細菌Ps. haloplanktis TAC125進行了比較。比較Ps. sp. SM9913和Ps. haloplanktis TAC125在黏土中的運動能力發(fā)現(xiàn),Ps. sp. SM9913在黏土中有較明顯的運動能力,而Ps. haloplanktis TAC125在黏土中的運動能力則檢測不到。鞭毛缺失突變株APF、ALF和ΔPFΔLF在黏土中的運動能力皆顯著低于野生型,其中ΔPFΔLF在黏土中的運動能力最差。這些結果表明,Ps. sp. SM9913在深海沉積物環(huán)境中可能具有游動和群涌運動兩種運動方式,而且極生鞭毛和側生鞭毛驅(qū)動了這些運動。通過檢索部分已測序的海洋細菌的基因組,我們發(fā)現(xiàn)具有兩套鞭毛系統(tǒng)的現(xiàn)象在分離自深海沉積物的菌株中普遍存在。(7)深海沉積物細菌Pseudoalteromonas. sp. SM9913的生活方式的模型的提出總結本文中我們對Ps. sp. SM9913的生活方式的研究結果,我們提出了一個描述其生活方式的模型。在深海沉積物中,Ps. sp. SM9913可通過游動聚集于營養(yǎng)顆粒周圍,并在胞外多糖的作用下附著于營養(yǎng)顆粒上或周圍的黏土顆粒上。附著生活的細菌利用營養(yǎng)顆粒上的營養(yǎng)生長繁殖,由于細菌的生長繁殖使得局部的某些必需營養(yǎng)物質(zhì)耗盡。為了快速逃離這個營養(yǎng)耗盡的區(qū)域去尋找新的營養(yǎng)顆粒,這些Ps. sp. SM9913細菌群體可能會表達出側生鞭毛通過群涌運動逃離顆粒。當細菌離開顆粒表面進入顆粒間的間隙水中,細胞群體的運動可能會轉換為游動,細胞利用游動通過間隙水到達下一個營養(yǎng)顆粒表面,進行附著生活。這個模型首次較為全面的描繪了深海沉積物細菌在其原位生境中可能的生活方式,為進一步研究深海沉積物細菌的環(huán)境適應機制和生態(tài)功能奠定了基礎。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q93

【共引文獻】

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