本文關(guān)鍵詞：深海沉積物細(xì)菌Pseudoaiteromonas sp.SM9913適應(yīng)環(huán)境的生活方式及其生理與遺傳機(jī)制

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【摘要】：在復(fù)雜的海洋生態(tài)系統(tǒng)中,異養(yǎng)細(xì)菌是溶解有機(jī)物和顆粒有機(jī)物的主要分解者,因此異養(yǎng)細(xì)菌在海洋生境的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中起到了非常重要的作用。海洋沉積物中存在大量從上層海水沉積而來(lái)的顆粒有機(jī)物,底棲細(xì)菌作為這些顆粒有機(jī)物的主要分解者,是沉積物中物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)的關(guān)鍵一環(huán)。研究底棲細(xì)菌的生活方式有助于了解其和海洋沉積物環(huán)境之間的相互作用,進(jìn)而幫助我們理解底棲細(xì)菌對(duì)海洋沉積物環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制和其生態(tài)功能。但是,針對(duì)底棲細(xì)菌的生活方式的研究卻罕有報(bào)道。Pseudoalteromonas sp. SM9913 (Ps. sp. SM9913)是分離自沖繩海槽表層沉積物的一株典型深海沉積物異養(yǎng)細(xì)菌。在前期研究中,實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)對(duì)該菌株的胞外蛋白酶系、胞外多糖和基因組等進(jìn)行了研究。在前期研究的基礎(chǔ)上,本文研究了Ps. sp. SM9913適應(yīng)深海沉積物環(huán)境的生活方式。通過(guò)生理學(xué)、遺傳學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究,我們初步揭示了Ps. sp. SM9913的生活方式的相關(guān)機(jī)制,并提出了其可能的生活方式模型。(1)深海沉積物細(xì)菌Ps. sp. SM9913顆粒附著的生活方式及其遺傳機(jī)制在前期對(duì)Ps. sp. SM9913的胞外多糖的研究基礎(chǔ)上,我們推測(cè)其在深海沉積物環(huán)境中可能具有顆粒附著的生活方式。通過(guò)測(cè)定與黏土顆粒的結(jié)合能力,我們發(fā)現(xiàn)Ps. sp. SM9913具有與浮游細(xì)菌Pseudoalteromonas. haloplanktis TAC125 (Ps. haloplanktis TAC125)相近的黏土結(jié)合能力,表明其可能具有顆粒附著的生活方式。而胞外多糖合成缺陷株ΔepsT的黏土顆粒結(jié)合能力則顯著低于野生型,ΔepsT中基因epsT的回補(bǔ)表達(dá)能夠使其顆粒結(jié)合能力恢復(fù)至野生型水平。這表明了胞外多糖在Ps.sp. SM9913的顆粒附著的生活方式中的重要作用。(2)深海沉積物細(xì)菌Ps. sp. SM9913的游動(dòng)和群涌運(yùn)動(dòng)的表征前期對(duì)Ps. sp. SM9913的比較基因組學(xué)的分析發(fā)現(xiàn)其具有兩套鞭毛系統(tǒng),一個(gè)有37個(gè)基因的基因簇被認(rèn)為是其側(cè)生鞭毛基因簇,負(fù)責(zé)合成側(cè)生鞭毛。而另外兩個(gè)分別有34個(gè)和22個(gè)基因的基因簇被認(rèn)為是其極生鞭毛系統(tǒng),負(fù)責(zé)合成極生鞭毛。為驗(yàn)證基因組學(xué)分析的結(jié)果,我們首先檢測(cè)了Ps. sp. SM9913的運(yùn)動(dòng)能力,結(jié)果表明其具有群涌和游動(dòng)兩種運(yùn)動(dòng)能力。我們利用倒置顯微鏡進(jìn)一步對(duì)Ps. sp. SM9913的群涌菌落邊緣進(jìn)行了原位觀察,發(fā)現(xiàn)其群涌菌落邊緣的細(xì)胞排列在一個(gè)單細(xì)胞層中,且細(xì)胞在此單細(xì)胞層中隨機(jī)運(yùn)動(dòng),菌落之外的細(xì)胞則不能運(yùn)動(dòng)。這種群涌方式與之前報(bào)道的大腸桿菌和枯草芽苞桿菌的群涌方式不同。為確認(rèn)Ps. sp. SM9913的游動(dòng)和群涌運(yùn)動(dòng)的“運(yùn)動(dòng)器官”,我們利用原子力顯微鏡對(duì)Ps. sp. SM9913的游動(dòng)狀態(tài)和群涌狀態(tài)的細(xì)胞進(jìn)行了觀察,結(jié)果表明游動(dòng)狀態(tài)的細(xì)胞具有單個(gè)短的極生鞭毛,而群涌狀態(tài)的細(xì)胞則具有多條側(cè)生鞭毛。這些結(jié)果驗(yàn)證了前期的基因組學(xué)分析的結(jié)果,并第一次較為系統(tǒng)地表征了一株海洋細(xì)菌的游動(dòng)和群涌運(yùn)動(dòng)。(3)深海沉積物細(xì)菌Ps. sp. SM9913的游動(dòng)和群涌的遺傳基礎(chǔ)為進(jìn)一步驗(yàn)證側(cè)生鞭毛基因簇和極生鞭毛基因簇分別為Ps.sp. SM9913的群涌運(yùn)動(dòng)和游動(dòng)的遺傳基礎(chǔ)。我們利用基因敲除技術(shù)對(duì)Ps. sp. SM9913的基因組中兩個(gè)鞭毛系統(tǒng)分別進(jìn)行了破壞。在側(cè)生鞭毛基因簇中,敲除了基因PSM_A0914和PSM_A0915后得到了側(cè)生鞭毛缺失突變株△LF。運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)表明△LF喪失了群涌運(yùn)動(dòng)能力。在突變株△LF中回補(bǔ)被敲除的基因PSM_A0914和PSM_A0915后,其恢復(fù)了群涌運(yùn)動(dòng)能力。在極生鞭毛基因簇中,敲除了基因PSM_A2283、PSM_A2282和PSM_A2281后得到了側(cè)生鞭毛缺失突變株△PF。運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)表明△PF喪失了游動(dòng)能力。在突變株△PF中回補(bǔ)被敲除的PSM_A2283、PSM_A2282和PSM_A2281后,其游動(dòng)能力恢復(fù)到野生株的水平。在突變株△PF中敲除了基因PSM_A0914和PSM_A0915后得到了側(cè)生鞭毛和極生鞭毛都缺失的突變株APFALF。運(yùn)動(dòng)性實(shí)驗(yàn)表明APFALF喪失了游動(dòng)和群涌運(yùn)動(dòng)能力。在APFALF回補(bǔ)了被敲除的基因PSM_A0914、PSM_A0915、PSM_A2283、PSM_A2282和PSM_A2281后,其游動(dòng)和群涌運(yùn)動(dòng)能力都恢復(fù)至野生型水平。這些研究結(jié)果證實(shí)了Ps. sp. SM9913的群涌運(yùn)動(dòng)和游動(dòng)的遺傳基礎(chǔ)分別是側(cè)生鞭毛基因簇和極生鞭毛基因簇。(4)深海沉積物細(xì)菌Ps. sp. SM9913的游動(dòng)和群涌運(yùn)動(dòng)的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析為進(jìn)一步了解Ps.sp. SM9913的群涌運(yùn)動(dòng)與游動(dòng)之間的相互聯(lián)系和區(qū)別及相關(guān)調(diào)控機(jī)制,我們分別對(duì)這兩種運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下的細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并比較了兩種狀態(tài)下基因的差異表達(dá)情況。比較結(jié)果表明,差異表達(dá)的基因中有946個(gè)是在群涌運(yùn)動(dòng)狀態(tài)中上調(diào)表達(dá)的,而在群涌運(yùn)動(dòng)狀態(tài)中下調(diào)表達(dá)的基因僅有76個(gè)�；蚪M分析預(yù)測(cè)的側(cè)生鞭毛基因簇中所有基因在群涌狀態(tài)中都是上調(diào)表達(dá)的,且我們發(fā)現(xiàn)側(cè)生鞭毛基因簇上下游共計(jì)3個(gè)基因也具有類似的上調(diào)表達(dá)。比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)這3個(gè)基因也與鞭毛的合成組裝有關(guān),由此我們對(duì)基因組分析預(yù)測(cè)的側(cè)生鞭毛基因簇作了進(jìn)一步的補(bǔ)充完善。我們利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明,選取的4個(gè)側(cè)生鞭毛基因簇中的基因皆是在群涌細(xì)胞中顯著上調(diào)表達(dá)的；而3個(gè)極生鞭毛基因簇中的基因則都是在群涌細(xì)胞中略微下調(diào)表達(dá)的。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的結(jié)果證實(shí)了我們的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果是可靠的。轉(zhuǎn)錄組比較分析發(fā)現(xiàn),編碼甲基化受體趨化性蛋白的基因21個(gè)中有18個(gè)是在群涌狀態(tài)的細(xì)胞中顯著上調(diào)表達(dá)的。其中上調(diào)表達(dá)最明顯的是基因PSM_A2360,其編碼的蛋白的同源蛋白Tsr在Escherichia coli中已被證實(shí)參與到群涌運(yùn)動(dòng)的信號(hào)傳遞中。這說(shuō)明在Ps. sp. SM9913中可能存在類似的信號(hào)途徑。在Ps. sp. SM9913的群涌狀態(tài)的細(xì)胞中,大量與第二信使環(huán)二鳥苷酸單磷酸(c-di-GMP)的合成、降解、相互作用有關(guān)的蛋白的編碼基因顯著地上調(diào)表達(dá)。且在Ps. sp. SM9913的側(cè)生鞭毛基因簇中的基因PSM_A0906編碼的蛋白是一個(gè)長(zhǎng)133個(gè)氨基酸僅具有一個(gè)PliZ單結(jié)構(gòu)域的蛋白,而蛋白中的PliZ結(jié)構(gòu)域已被證明是可以與c-di-GMP結(jié)合的。這些結(jié)果暗示第二信使c-di-GMP可能參與到了Ps. sp. SM9913的運(yùn)動(dòng)性的調(diào)控中。編碼三對(duì)雙組分調(diào)控系統(tǒng)元件的6個(gè)基因在群涌細(xì)胞中是顯著上調(diào)表達(dá)的,且這三對(duì)雙組分調(diào)控系統(tǒng)元件在Ps. sp. SM9913的相近種Ps. haloplanktis TAC125是沒有直系同源蛋白的。其中PSM_A0531和PSM_A0532組成的雙組分調(diào)控系統(tǒng)可能直接調(diào)控Ps. sp. SM9913的側(cè)生鞭毛基因簇的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。第二對(duì)雙組分調(diào)控系統(tǒng)由PSM_A2131和PSM_A2132組成,可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP的濃度參與到Ps. sp. SM9913的運(yùn)動(dòng)性調(diào)控中。PSM_B0075和PSM_B0076所組成的雙組分調(diào)控系統(tǒng)可能通過(guò)群體感應(yīng)調(diào)控Ps. sp. SM9913的運(yùn)動(dòng)性。鐵載體受體蛋白和鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因在群涌狀態(tài)的細(xì)胞中都顯著地上調(diào)表達(dá),而與鐵儲(chǔ)存相關(guān)蛋白和一些含鐵蛋白的編碼基因則在群涌狀態(tài)的細(xì)胞中顯著地下調(diào)表達(dá)。測(cè)定結(jié)果表明,我們所用的液體海水培養(yǎng)基中鐵離子濃度為4.64±0.07μM。在群涌運(yùn)動(dòng)的培養(yǎng)中加入終濃度從1μM到10μM的FeCl3發(fā)現(xiàn)外源添加的FeCl3會(huì)抑制Ps. sp. SM9913的群涌運(yùn)動(dòng),濃度越高的FeCl3抑制作用越明顯。生長(zhǎng)曲線測(cè)定實(shí)驗(yàn)表明在培養(yǎng)基中添加同樣濃度的FeCl3并不影響Ps. sp. SM9913的正常生長(zhǎng)。這些結(jié)果表明,環(huán)境中鐵的缺乏可能會(huì)誘導(dǎo)Ps. sp. SM9913的群涌運(yùn)動(dòng)。比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究很好地補(bǔ)充了前期基因組學(xué)和遺傳學(xué)的研究,初步揭示了Ps.sp.SM9913的游動(dòng)和群涌?jī)煞N運(yùn)動(dòng)方式的生理機(jī)制,為進(jìn)一步詳細(xì)研究其運(yùn)動(dòng)性的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。(5)胞外多糖在Ps. sp. SM9913的群涌運(yùn)動(dòng)中的作用細(xì)菌菌落的粘液層對(duì)群涌運(yùn)動(dòng)有重要的作用,而胞外多糖是粘液層的主要組分之一。我們利用Ps. sp. SM9913的胞外多糖合成缺陷株ΔepsT研究了胞外多糖在其群涌運(yùn)動(dòng)中的作用。比較分析發(fā)現(xiàn)AepsT同樣具有群涌運(yùn)動(dòng)能力但其群涌菌落大小明顯小于野生型菌株,說(shuō)明胞外多糖的缺失削弱了其群涌運(yùn)動(dòng)能力。定量分析Ps. sp. SM9913和ΔepsT的群涌運(yùn)動(dòng)菌落直徑發(fā)現(xiàn),野生型Ps. sp.SM9913的菌落擴(kuò)張速度的變化趨勢(shì)是先增大后減小,呈倒鐘形。而突變株AepsT的菌落擴(kuò)張速度在起初為最大,并呈逐漸減小的趨勢(shì)。Ps. sp. SM9913的群涌運(yùn)動(dòng)具有起初的延遲期且是密度依賴的。而ΔepsT的群涌運(yùn)動(dòng)不具有延遲期,且不是密度依賴的。在群涌運(yùn)動(dòng)的培養(yǎng)基上添加surfactin可以回補(bǔ)ΔepsT的運(yùn)動(dòng)缺陷,其群涌運(yùn)動(dòng)菌落可以恢復(fù)至野生型大小但是其菌落直徑的變化趨勢(shì)與野生型有較明顯的差異。而添加Ps. sp. SM9913所分泌的胞外多糖能夠部分回補(bǔ)其群涌運(yùn)動(dòng)缺陷。這些結(jié)果表明胞外多糖在Ps. sp. SM9913的群涌運(yùn)動(dòng)具有一定的調(diào)控作用,能幫助我們理解胞外多糖在其生活方式中的意義。(6) Ps. sp. SM9913在深海沉積物中運(yùn)動(dòng)生活方式的模擬研究我們進(jìn)一步用黏土模擬深海沉積物環(huán)境,分析了Ps. sp. SM9913及其突變株在黏土中的運(yùn)動(dòng)能力,并與浮游細(xì)菌Ps. haloplanktis TAC125進(jìn)行了比較。比較Ps. sp. SM9913和Ps. haloplanktis TAC125在黏土中的運(yùn)動(dòng)能力發(fā)現(xiàn),Ps. sp. SM9913在黏土中有較明顯的運(yùn)動(dòng)能力,而Ps. haloplanktis TAC125在黏土中的運(yùn)動(dòng)能力則檢測(cè)不到。鞭毛缺失突變株APF、ALF和ΔPFΔLF在黏土中的運(yùn)動(dòng)能力皆顯著低于野生型,其中ΔPFΔLF在黏土中的運(yùn)動(dòng)能力最差。這些結(jié)果表明,Ps. sp. SM9913在深海沉積物環(huán)境中可能具有游動(dòng)和群涌運(yùn)動(dòng)兩種運(yùn)動(dòng)方式,而且極生鞭毛和側(cè)生鞭毛驅(qū)動(dòng)了這些運(yùn)動(dòng)。通過(guò)檢索部分已測(cè)序的海洋細(xì)菌的基因組,我們發(fā)現(xiàn)具有兩套鞭毛系統(tǒng)的現(xiàn)象在分離自深海沉積物的菌株中普遍存在。(7)深海沉積物細(xì)菌Pseudoalteromonas. sp. SM9913的生活方式的模型的提出總結(jié)本文中我們對(duì)Ps. sp. SM9913的生活方式的研究結(jié)果,我們提出了一個(gè)描述其生活方式的模型。在深海沉積物中,Ps. sp. SM9913可通過(guò)游動(dòng)聚集于營(yíng)養(yǎng)顆粒周圍,并在胞外多糖的作用下附著于營(yíng)養(yǎng)顆粒上或周圍的黏土顆粒上。附著生活的細(xì)菌利用營(yíng)養(yǎng)顆粒上的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)繁殖,由于細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖使得局部的某些必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡。為了快速逃離這個(gè)營(yíng)養(yǎng)耗盡的區(qū)域去尋找新的營(yíng)養(yǎng)顆粒,這些Ps. sp. SM9913細(xì)菌群體可能會(huì)表達(dá)出側(cè)生鞭毛通過(guò)群涌運(yùn)動(dòng)逃離顆粒。當(dāng)細(xì)菌離開顆粒表面進(jìn)入顆粒間的間隙水中,細(xì)胞群體的運(yùn)動(dòng)可能會(huì)轉(zhuǎn)換為游動(dòng),細(xì)胞利用游動(dòng)通過(guò)間隙水到達(dá)下一個(gè)營(yíng)養(yǎng)顆粒表面,進(jìn)行附著生活。這個(gè)模型首次較為全面的描繪了深海沉積物細(xì)菌在其原位生境中可能的生活方式,為進(jìn)一步研究深海沉積物細(xì)菌的環(huán)境適應(yīng)機(jī)制和生態(tài)功能奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q93

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1226106