本文關(guān)鍵詞：腸道傳播肝炎病毒的黏膜免疫研究

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【摘要】：腸道傳播的肝炎病毒包括甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus, HAV)和戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV),二者均屬單股正鏈RNA病毒,無(wú)包膜,主要通過(guò)糞口途徑傳播,并且兩種病毒在臨床癥狀、暴發(fā)特征和流行病學(xué)特征等方面也有許多相似之處。在發(fā)展中國(guó)家,HAV和HEV能導(dǎo)致嚴(yán)重的疾病暴發(fā),造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。已有文獻(xiàn)報(bào)道因飲用被甲肝病毒和戊肝病毒污染的水源而導(dǎo)致甲型肝炎和戊型肝炎同時(shí)暴發(fā)的病例。目前,雖然有有效的甲肝疫苗和戊肝疫苗,但是尚沒(méi)有甲肝和戊肝的聯(lián)合疫苗可同時(shí)預(yù)防甲肝和戊肝的暴發(fā)。并且,常規(guī)的肌肉注射方式與自然感染途徑不同,主要誘導(dǎo)血清中IgG的產(chǎn)生,有一定的局限性。而黏膜免疫可以模擬HAV和HEV的自然感染方式,既能誘導(dǎo)局部IgA的產(chǎn)生還可以誘導(dǎo)全身IgG的產(chǎn)生。而且,聯(lián)合的黏膜免疫比傳統(tǒng)的肌肉注射策略更為安全、經(jīng)濟(jì),且易于被目標(biāo)人群所接受,操作也更加方便。因此,針對(duì)HAV和HEV的黏膜疫苗是目前最具潛力的疫苗候選制劑之一。為了增強(qiáng)本課題制備的蛋白抗原的黏膜免疫應(yīng)答,我們選取了一段具有靶向作用的tuftsin基因,該基因的編碼產(chǎn)物是一種小分子免疫刺激肽,其專(zhuān)一性受體存在于巨噬細(xì)胞、樹(shù)突細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等細(xì)胞表面,當(dāng)tuftsin與其靶細(xì)胞膜受體特異性結(jié)合后,可作為免疫刺激因子增強(qiáng)吞噬細(xì)胞對(duì)抗原的吞噬、遷移及轉(zhuǎn)運(yùn)能力,從而提高與其相連的蛋白的免疫原性。本課題探討了與tuftsin相連的甲型和戊型肝炎病毒中和抗原表位的重組蛋白的黏膜免疫應(yīng)答,為制備HAV和HEV雙價(jià)黏膜候選疫苗提供理論基礎(chǔ)。我們把含有中和抗原表位的HAV VP1蛋白的部分序列(aa 1-199)和HEV ORF2的部分序列(aa 368-607)作為目的基因,通過(guò)基因優(yōu)化、重組以及PCR、基因克隆、原核表達(dá)、蛋白純化、蛋白鑒定等技術(shù)手段將tuftsin分別與HAV VP1(aal-199), HEV ORF2(aa368-607)N端通過(guò)甘氨酸linker相連,制備重組抗原蛋白。將上述兩種嵌合抗原基因插入表達(dá)載體pET43a,構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET43a-HA-VP1-tuftsin、pET43a-HE-ORF2-tuftsin,同時(shí)構(gòu)建不含tuftsin和linker的對(duì)照組質(zhì)粒pET43a-HA-VP1及pET43a-HE-ORF2,然后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21進(jìn)行表達(dá)。結(jié)果表明pET43a-HA-VP1-tuftsin及對(duì)照質(zhì)粒pET43a-HA-VP1, pET43a-HE-ORF2-tuftsin及其對(duì)照質(zhì)粒pET43a-HE-ORF2均能在BL21中高效表達(dá),表達(dá)的重組蛋白相對(duì)分子質(zhì)量分別約為23KD、23KD、28KD、 28KD。通過(guò)陰離子交換、蛋白透析復(fù)性和蛋白濃縮等技術(shù)得到高純度的四種抗原蛋白HA-VP1-tuftsin. HA-VP1、HE-ORF2-tuftsin和HE-ORF2。之后通過(guò)Western blotting和ELISA鑒定蛋白,實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示HA-VP1-tuftsin和HA-VP1重組抗原蛋白能與HAV抗體陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng),HE-ORF2-tuftsin和HE-ORF2重組抗原蛋白能與HEV抗體陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。此外,我們通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)分別證實(shí)了HA-VP1-tuftsin、HE-ORF2-tuftsin的抗原性和免疫原性。首先對(duì)重組蛋白HA-VP1-tuftsin、HE-ORF2-tuftsin及其對(duì)照蛋白HA-VP1、HE-ORF2的免疫原性進(jìn)行了比較。Balb/c小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,在滴鼻免疫組,tuftsin增強(qiáng)了抗-HAV和抗-HEV的特異性IgG和IgA抗體滴度,說(shuō)明tuftsin可以促進(jìn)特異性IgG的增多,同時(shí)也能促進(jìn)IgA在腸道、陰道、呼吸道和糞便的分泌和產(chǎn)生,提示了tuftsin通過(guò)滴鼻免疫能有效地激活體液免疫應(yīng)答；在肌肉注射組中,tuftsin同樣能夠增加特異性IgG的滴度但I(xiàn)gA滴度增加的現(xiàn)象卻并不明顯。此外,ELISPOT實(shí)驗(yàn)證明,無(wú)論通過(guò)肌肉注射還是滴鼻免疫,tuftsin組分泌IFN-γ的T細(xì)胞增殖都較為明顯,這顯示了tuftsin可以有效地激活Thl類(lèi)細(xì)胞免疫應(yīng)答。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明,無(wú)論在肌肉注射組還是滴鼻免疫組,tuftsin組與其他組相比,CD4+T細(xì)胞都有所增加而CD8+T細(xì)胞則有所減少,這使得CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞比例相對(duì)對(duì)照組明顯上升,但是肌肉注射組和滴鼻免疫組之間沒(méi)有顯著差異,這些數(shù)據(jù)證明tuftsin可以誘發(fā)機(jī)體特異性CD4+T細(xì)胞的分化,抑制CD8+T細(xì)胞的增殖。因此,將免疫刺激性分子tuftsin與目的抗原基因連接起來(lái),不但可以加強(qiáng)機(jī)體針對(duì)抗原蛋白的體液免疫還可以增強(qiáng)其細(xì)胞免疫反應(yīng)。并且綜合體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫應(yīng)答兩方面的結(jié)果顯示,滴鼻免疫方式能夠更有效的發(fā)揮tuftsin在增強(qiáng)黏膜免疫應(yīng)答方面的作用。同時(shí),我們的研究也詳細(xì)探討了蛋白組分HA-VP1-tuftsin和HE-ORF2-tuftsin通過(guò)滴鼻聯(lián)合免疫之后,可能存在的關(guān)系及是否會(huì)有互相抑制作用。研究結(jié)果表明,聯(lián)合免疫后HA-VP1-tuftsin的免疫原性顯著提高,抗-HAV的特異性抗體IgG和黏膜IgA滴度均有所增加,在ELISPOT試驗(yàn)中,聯(lián)合免疫后產(chǎn)生的IFN-y斑點(diǎn)數(shù)也高于單獨(dú)免疫HAV-VP1-tuftisn蛋白組。而HE-ORF2-tuftsin蛋白的免疫原性雖然沒(méi)有顯著提高但也未受到抑制。綜上所述,聯(lián)合免疫后這兩種蛋白組分沒(méi)有互相抑制作用,并且HAV-VP1-tuftisn蛋白的免疫原性有所增加。綜上所述,本研究通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功地表達(dá)和純化了分別含有HAV和HEV中和抗原表位并且連有免疫佐劑分子tuftsin的抗原蛋白,在Balb/c小鼠中通過(guò)滴鼻和肌肉注射兩種方式,探討tuftsin能否增強(qiáng)蛋白的黏膜免疫原性。結(jié)果顯示tuftsin基因能夠有效增強(qiáng)偶聯(lián)的目的蛋白的免疫原性,從而增強(qiáng)機(jī)體的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。并且滴鼻的方式較肌肉注射的免疫方式產(chǎn)生的黏膜免疫應(yīng)答更有優(yōu)勢(shì)。兩種有優(yōu)勢(shì)的tuftsin蛋白HA-VP1-tuftsin和HE-ORF2-tuftsin之間沒(méi)有互相抑制作用,而且HA-VP1-tuftsin蛋白激發(fā)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答在聯(lián)合免疫后均有所增強(qiáng)。因此,含有tuftsin的HAV和HEV蛋白能夠有效誘導(dǎo)產(chǎn)生廣泛的免疫反應(yīng),具有開(kāi)發(fā)為可同時(shí)預(yù)防HAV和HEV感染的亞單位聯(lián)合蛋白疫苗的應(yīng)用前景。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R373.21

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本文編號(hào)：1221975