本文關(guān)鍵詞：干擾素反應(yīng)調(diào)控因子IRF3的入核機(jī)制研究

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【摘要】：天然免疫(又稱先天免疫或固有免疫)反應(yīng)是宿主抵抗病原微生物入侵的第一道防線。宿主細(xì)胞在受到病毒感染后,細(xì)胞內(nèi)的模式識(shí)別受體(pathogen recognition receptors, PRRs)識(shí)別病毒的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs),激活下游一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件,從而誘導(dǎo)I型干擾素、炎癥因子以及下游抗病毒效應(yīng)蛋白的表達(dá)。這些下游細(xì)胞因子和效應(yīng)蛋白可以抑制病毒的復(fù)制,清除被感染的細(xì)胞,促進(jìn)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的發(fā)生。精準(zhǔn)的亞細(xì)胞定位對(duì)信號(hào)通路分子有效地發(fā)揮功能起著重要的作用,尤其是對(duì)于轉(zhuǎn)錄因子來說,蛋白質(zhì)的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至關(guān)重要。干擾素調(diào)節(jié)因子3 (Interferon Regulatory Factor 3，IRF3)是病毒誘導(dǎo)I型干擾素表達(dá)通路中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,在宿主抗病毒天然免疫應(yīng)答中扮演重要角色。病毒感染細(xì)胞后,會(huì)引起IRF3的C端磷酸化、二聚化,進(jìn)而進(jìn)入細(xì)胞核,與共激活因子CBP/p300形成復(fù)合物后結(jié)合到IFN-p基因的PRD (positive regulatory domain)區(qū)域或者是其他目的基因的 ISRE (interferon-stimulated response element)序列上,從而誘導(dǎo)I型干擾素以及下游抗病毒效應(yīng)蛋白的表達(dá)。IRF3在抗病毒天然免疫反應(yīng)中的作用依賴于其進(jìn)入細(xì)胞核中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性,因此,IRF3的入核轉(zhuǎn)運(yùn)在IRF3的抗病毒功能中起著關(guān)鍵的作用。小分子蛋白可以自由穿梭核孔復(fù)合物,但大分子蛋白(大于40 KD)的核質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)需要轉(zhuǎn)運(yùn)受體及載體分子來介導(dǎo)其通過核孔復(fù)合物。貨物蛋白被受體識(shí)別需要位于其表面的一段氨基酸序列,被稱為核定位信號(hào)(Nuclear Localization Signal, NLS)或出核信號(hào)(Nuclear Export Signal, NES)。經(jīng)典的NLS分為單簇堿性氨基酸NLS (monopartite NLS)和雙簇堿性氨基酸殘基NLS (bipartite NLS)o IRF家族一共有9個(gè)成員,過去對(duì)IRF家族蛋白的細(xì)胞亞定位已經(jīng)有很多研究,并且大多數(shù)IRF家族成員的NLS都已得到鑒定,但I(xiàn)型干擾素誘導(dǎo)通路關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子IRF3的NLS本質(zhì)及入核調(diào)控機(jī)制仍然不夠清楚。在本項(xiàng)研究中,我們發(fā)現(xiàn)IRF3包含一個(gè)既控制DNA結(jié)合能力又負(fù)責(zé)入核轉(zhuǎn)運(yùn)的雙元件核定位信號(hào)。首先,我們通過截短突變IRF3,并與綠色熒光蛋白融合表達(dá),發(fā)現(xiàn)在IRF3的DNA結(jié)合區(qū)域及毗鄰區(qū)域(氨基酸序列64～130)存在一段控制入核信號(hào)的序列。進(jìn)一步對(duì)該區(qū)域的堿性氨基酸進(jìn)行點(diǎn)突變,我們鑒定出了負(fù)責(zé)IRF3入核轉(zhuǎn)運(yùn)的兩段關(guān)鍵堿性氨基酸簇。IRF3的雙元件核定位信號(hào)包含兩處堿性氨基酸簇,77KR78和86RK87,分別對(duì)應(yīng)Importin-α的次要結(jié)合位點(diǎn)和主要結(jié)合位點(diǎn)。突變77KR78會(huì)嚴(yán)重抑制IRF3的入核能力,而突變86RK87則讓IRF3徹底失去入核能力。免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了我們的結(jié)論。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),IRF3的雙元件核定位信號(hào)對(duì)其DNA結(jié)合活性也很關(guān)鍵,這說明IRF3的入核信號(hào)區(qū)和DNA識(shí)別結(jié)合區(qū)是整合在一起的,這與其他的干擾素調(diào)節(jié)因子不同。最后,通過病毒感染和干擾素生物活性實(shí)驗(yàn),我們證明IRF3的NLS區(qū)域?qū)τ贗RF3介導(dǎo)的干擾素的產(chǎn)生和抗病毒免疫應(yīng)答是必需的�？傊�,我們的研究揭示了以前從未發(fā)現(xiàn)的存在于IRF3上的雙元件核定位信號(hào),這一核定位信號(hào)不僅具有細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)的功能,還能控制IRF3的DNA結(jié)合活性,這對(duì)闡明IRF3功能的調(diào)節(jié)和IRF3介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)機(jī)制具有重要意義。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q939.91

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