本文關(guān)鍵詞：工程乙酰輔酶A通路構(gòu)建釀酒酵母高效合成平臺

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【摘要】：乙酰輔酶A (acetyl-CoA)是微生物細(xì)胞內(nèi)重要的前體分子,直接參與了包括三羧酸循環(huán)、脂類代謝、氨基酸代謝、萜類代謝在內(nèi)的近200個(gè)生化反應(yīng)。采用代謝工程和合成生物學(xué)策略改造乙酰輔酶A代謝通路合成不同的精細(xì)化學(xué)品是目前研究的熱點(diǎn)。本文以3羥基丙酸、脂肪酸和beta-胡蘿卜素為靶向產(chǎn)品,通過工程不同的代謝途徑建立釀酒酵母平臺細(xì)胞工廠用于生產(chǎn)乙酰輔酶A衍生的產(chǎn)品。3羥基丙酸在化工行業(yè)中是一種非常重要的化合物,該產(chǎn)品被美國能源部評定為12種平臺化合物之一。由于3羥基丙酸具有一個(gè)羥基基團(tuán)和一個(gè)羧基基團(tuán),使其成為一個(gè)非常優(yōu)秀的化合物,可作為化工材料的建造基石。3羥基丙酸在化工行業(yè)有著巨大的市場需求,通過改造微生物高效合成3羥基丙酸近年來備受關(guān)注。到目前為止,通過工程改造不同的代謝途徑均已成功合成3羥基丙酸,主要集中于甘油途徑和丙二酰輔酶A途徑,且以甘油途徑研究最為廣泛。而相對于甘油途徑,丙二酰輔酶A途徑有其獨(dú)特的優(yōu)勢：(1)由于不同的C5和C6糖代謝均可合成中間代謝分子乙酰輔酶A,因此這些廉價(jià)且來源廣泛的碳源可作為3羥基丙酸合成的原料；(2)從葡萄糖代謝合成3羥基丙酸在碳源利用和能量代謝上實(shí)現(xiàn)了很好的平衡,理論上可以實(shí)現(xiàn)很高的轉(zhuǎn)化率。本文首次引入來源于Metallosphaera sedula的醇脫氫酶MCR和醛脫氫酶MSR用于合成3羥基丙酸。為了研究3羥基丙酸合成系統(tǒng)的基本生化反應(yīng),我們在體外建立了以乙酰輔酶A為底物合成3羥基丙酸的反應(yīng)。通過滴定不同濃度的ACC, MCR和MSR,我們發(fā)現(xiàn)ACC和MCR對3羥基丙酸的合成速率影響較大,而MSR對3羥基丙酸的合成速率影響較小。另外,我們在體外分析了3羥基丙酸和脂肪酸合成的競爭關(guān)系。在體內(nèi),我們首先評估了大腸桿菌和三個(gè)酵母菌株合成3羥基丙酸的能力。隨后我們在大腸桿菌中通過啟動(dòng)子文庫調(diào)節(jié)了MCR蛋白的表達(dá)。最后我們通過不同的代謝工程策略進(jìn)一步提高了菌株合成3羥基丙酸的能力。我們相信本文所述的工作對進(jìn)一步研究乙酰輔酶A途徑合成3羥基丙酸產(chǎn)品將會提供重要的參考價(jià)值。脂肪酸是生物燃料分子(如脂肪酸酯、脂肪烷烴和脂肪醇)的重要前體。在之前的研究中,本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立了大腸桿菌脂肪酸體外合成體系�；谠擉w系,脂肪酸合成的限速步驟和基本生化性質(zhì)被挖掘。隨后我們將該工作拓展到更有工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的釀酒酵母中去,以期搭建更面向產(chǎn)業(yè)化的“細(xì)胞工廠”。釀酒酵母中的脂肪酸合成系統(tǒng)和大腸桿菌略存在些差異。細(xì)胞質(zhì)中生成乙酰輔酶A的途徑要略微繁雜。脂肪酸合成酶屬于類型Ⅰ脂肪酸合成酶,是一個(gè)12聚體的大型復(fù)合物。最后的產(chǎn)物以脂酰-CoA形式釋放,而不是類型Ⅱ中的脂酰-ACP。途徑中的ACS和ACC受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控和翻譯后修飾。在酵母中,脂肪酸激活為脂酰輔酶A后可進(jìn)行beta氧化。為了阻止該反應(yīng)的進(jìn)行,FAA1, FAA4和POX1基因被敲除。在三個(gè)基因同時(shí)被敲除后,脂肪酸的產(chǎn)量可以由出發(fā)菌株的48 mg/L提高到106 mg/L。在大腸桿菌的代謝工程改造中,硫酯酶被證明是至關(guān)重要的。因此來源于大腸桿菌、植物和釀酒酵母本身的硫酯酶被超表達(dá),結(jié)果表明只有超表達(dá)釀酒酵母本身的硫酯酶后脂肪酸產(chǎn)量有明顯提高,為115 mg/L。平行的,超表達(dá)前體乙酰輔酶A的供應(yīng)可以提高脂肪酸產(chǎn)量至124 mg/L,而超表達(dá)脂肪酸合成的起始步驟(ACC1蛋白催化)并沒有提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量。為了分析釀酒酵母中脂肪酸合成體系的主要限速步驟,釀酒酵母無細(xì)胞合成體系(cell-free)被成功建立。在釀酒酵母細(xì)胞萃取物中添加從釀酒酵母中純化的ACC,底物乙酰輔酶A和反應(yīng)需要的各種輔因子,沒有脂肪酸產(chǎn)物被檢測到。而在釀酒酵母細(xì)胞萃取物中滴定從大腸桿菌中純化的ACC,脂肪酸產(chǎn)物可以被檢測到。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明在釀酒酵母中脂肪酸合成的第一步反應(yīng)是該系統(tǒng)的主要限制性步驟。由于ACC的活性和磷酸化修飾有密切的聯(lián)系,因此為了為之后研究提供理論基礎(chǔ),我們進(jìn)一步鑒定了該蛋白磷酸化位點(diǎn)的修飾。使用的質(zhì)譜儀主要是LTQOrbitrap XL和Triple TOFTM 5600+。通過和數(shù)據(jù)庫比對,55個(gè)磷酸化位點(diǎn)被鑒定。之后通過MIDAS方法進(jìn)行人工校對。最后14個(gè)磷酸化位點(diǎn)被鑒定。主要分布為：5個(gè)位于BC(生物素羧化酶)區(qū),BCCP(生物素羧基載體蛋白)和CT(羧基轉(zhuǎn)移酶)區(qū)各一個(gè)。其他7個(gè)位于連接區(qū),且全部位于非活性位點(diǎn)。其影響機(jī)制雖然不是很清楚,但該工作為進(jìn)一步研究奠定了很好的基礎(chǔ)。beta-胡蘿卜素是類胡蘿卜素(Carotenoids)的一種,具有非常強(qiáng)的抗氧化性,可以預(yù)防、延緩和治療某些疾病,尤其是癌癥,同時(shí)也能提高機(jī)體的免疫功能。目前被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品和保健品行業(yè),具有廣闊的市場前景。天然提取的beta-胡蘿卜素產(chǎn)率較低且純化工藝復(fù)雜,需要花費(fèi)大量的人力和物力。通過化學(xué)合成beta-胡蘿卜素雖然成本較低,但是產(chǎn)生的毒副產(chǎn)物較多,難以達(dá)到食品級要求。因此通過微生物合成beta-胡蘿卜素受到研究者廣泛的青睞。我們首先特征性比較了釀酒酵母中半乳糖誘導(dǎo)相關(guān)啟動(dòng)子的表達(dá)強(qiáng)度,選取較強(qiáng)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子pGAL1, pGAL7, pGAL10和pGAL2用于控制beta-胡蘿卜素合成相關(guān)基因的表達(dá)。隨后通過敲除調(diào)控半乳糖相關(guān)的基因GAL80,實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的組成型表達(dá),使得構(gòu)建的菌株無需添加誘導(dǎo)劑半乳糖可以合成beta-胡蘿卜素產(chǎn)物。同時(shí)我們通過密碼子優(yōu)化合成來源于三孢布拉霉中beta-胡蘿卜素合成相關(guān)的基因,成功實(shí)現(xiàn)了在異源真核宿主內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。超表達(dá)了甲羥戊酸途徑中的基因以提高前體異戊烯焦磷酸和二甲基烯丙基焦磷酸的合成。通過這些技術(shù),在搖瓶發(fā)酵中,構(gòu)建的工程菌種能夠合成45 mg/L的beta-胡蘿卜素,同時(shí)產(chǎn)生29 mg/L的番茄紅素。隨后經(jīng)過碳源的優(yōu)化,工程菌株可以產(chǎn)生149 mg/L的總胡蘿卜素(64 mg/L的beta-胡蘿卜素和85 mg/L的番茄紅素)。為了進(jìn)一步提高產(chǎn)物beta-胡蘿卜素的積累,我們建立了中間產(chǎn)物的絕對定量方法,并通過中間產(chǎn)物的積累為下一步代謝工程改造提供靶標(biāo)。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q936

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本文編號：1145998