發(fā)布時(shí)間：2017-11-02 22:35

  本文關(guān)鍵詞：調(diào)控超長鏈脂肪酸合成關(guān)鍵基因?qū)χ参锓N子中脂肪酸組成的影響

  更多相關(guān)文章： 超長鏈脂肪酸 芥酸 神經(jīng)酸 甘藍(lán)型油菜 亞麻薺

【摘要】：超長鏈脂肪酸(Very Long Chain Fatty Acids,VLCFAs)是指碳原子數(shù)目超過18的脂肪酸。這類脂肪酸是真核生物必需的組成成分,其碳鏈的長度、不飽和程度以及頭部結(jié)構(gòu)的極性,為超長鏈脂肪酸的結(jié)構(gòu)和功能的多樣性提供了基礎(chǔ),在生物體中具有廣泛的生理功能。除此之外,超長鏈脂肪酸還是重要的化工原料,在工業(yè)、醫(yī)療、保健等領(lǐng)域具有不同的應(yīng)用價(jià)值。植物油作為清潔能源成為了超長鏈脂肪酸生產(chǎn)的主要原料,提高植物種子中超長鏈脂肪酸的含量也成為了重要的育種目標(biāo)。本研究通過調(diào)控植物中超長鏈脂肪酸合成途徑上的關(guān)鍵基因,來影響其種子中的脂肪酸組成,為提高植物種子中超長鏈脂肪酸的含量提供參考依據(jù)。我們以芥酸和神經(jīng)酸為例,針對其合成途徑的關(guān)鍵基因開展了研究,得到了以下結(jié)果:1.從甘藍(lán)型油菜基因組中克隆得到了FAE1基因在A、C基因組中相對應(yīng)的拷貝Bna A.FAE1和Bna C.FAE1。序列比對發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)拷貝的DNA序列之間存在21個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),但只有5個(gè)造成了氨基酸位點(diǎn)的差異。將克隆得到的Bna A.FAE1和Bna C.FAE1在亞麻薺種子中特異表達(dá),發(fā)現(xiàn)異源表達(dá)Bna A.FAE1的種子中C22:1含量比異源表達(dá)Bna C.FAE1的種子中含量高,而異源表達(dá)Bna C.FAE1的種子中C22:0的含量比異源表達(dá)Bna A.FAE1的種子高,說明Bna A.FAE1對單不飽和脂肪酸的親和力可能比Bna C.FAE1高,而Bna C.FAE1對飽和脂肪酸的親和力可能比Bna A.FAE1高。但在擬南芥fad2/fae1雙突變體和酵母細(xì)胞中表達(dá)這兩個(gè)基因時(shí)時(shí),沒有觀察到類似的現(xiàn)象。對甘藍(lán)型油菜祖先種白菜型油菜和甘藍(lán)種子脂肪酸組成的分析,也沒有觀察到類似的差異。2.利用油酸含量高且多不飽和脂肪酸含量低的甘藍(lán)型油菜與高芥酸油菜雜交,將突變的FAD2和FAD3基因?qū)敫呓嫠嵊筒说幕蚪M中,培育芥酸含量高且多不飽和脂肪酸含量低的油菜。為了避免向高芥酸油菜中導(dǎo)入突變的FAE1基因,我們開發(fā)了Bn FAE1基因的共顯性標(biāo)記,并結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室已開發(fā)的Bn FAD2和Bn FAD3的分子標(biāo)記,在F2群體中篩選得到了2株芥酸含量高且多不飽和脂肪酸含量低的油菜單株。通過對其后代連續(xù)觀察和芥酸測定,確認(rèn)我們得到了C18:2含量低于10%,亞麻酸含量低于5%,芥酸含量高于40%的高芥酸、低多不飽和脂肪酸的甘藍(lán)型油菜,并驗(yàn)證了這3個(gè)分子標(biāo)記的準(zhǔn)確性。3.我們在甘藍(lán)型油菜種子中超表達(dá)Bn FAE1基因,可以將芥酸的含量由47%提高到了60%。在甘藍(lán)型油菜種子中反義抑制Bn FAD2基因的表達(dá),可將亞油酸的含量從12%降低到了7-8%,并且提高了油酸和芥酸的含量。將Bn FAE1超表達(dá)油菜株系與反義抑制Bn FAD2表達(dá)油菜株系雜交,在其F2單株中獲得了芥酸含量超過Bn FAE1超表達(dá)油菜親本的單株,芥酸含量最高達(dá)到63%。在甘藍(lán)型油菜中表達(dá)來自酵母的LPAAT基因SLC1和SLC1-1,以及甘藍(lán)的Bo LPAT基因,都不能在甘油骨架的sn-2位添加芥酸。在甘藍(lán)型油菜種子中共表達(dá)來自荷包蛋花的Ld LPAAT和Bna A.FAE1可以顯著提高油菜種子中芥酸的含量。將Ld LPAAT和Bna A.FAE1以及Bn LPAAT的RNAi抑制表達(dá)盒結(jié)構(gòu)在油菜種子中共表達(dá),同樣可以提高種子中芥酸含量。4.我們調(diào)查了脂肪酸碳鏈酶中KCR、HCD和ECR與KCS相結(jié)合對超長鏈脂肪酸生產(chǎn)的作用。我們將銀扇草中能夠生成神經(jīng)酸的La KCS在亞麻薺種子中表達(dá),可以在亞麻薺種子中合成其原本沒有的神經(jīng)酸,最高含量可以達(dá)到12%。將La KCS與擬南芥中的At KCR、At HCD和At ECR中的每個(gè)基因分別組合,構(gòu)建3個(gè)種子特異雙基因共表達(dá)載體,轉(zhuǎn)化亞麻薺,發(fā)現(xiàn)其種子中神經(jīng)酸的含量并沒有得到進(jìn)一步地提高。將La KCS和At KCR以及At HCD一起在亞麻薺種子中共表達(dá),仍然不能進(jìn)一步提高神經(jīng)酸的含量。對發(fā)育種子脂肪酸含量的動(dòng)態(tài)觀察表明,三基因共表達(dá)植株中神經(jīng)酸的含量在種子發(fā)育早期比La KCS單基因表達(dá)植株種子中的神經(jīng)酸含量高。以上結(jié)果表明,根據(jù)超長鏈脂肪酸合成途徑上關(guān)鍵基因的特點(diǎn),通過對其表達(dá)的調(diào)控,可以提高超長鏈脂肪酸的含量。本研究為高含量超長鏈脂肪酸的育種提供了參考依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：超長鏈脂肪酸 芥酸 神經(jīng)酸 甘藍(lán)型油菜 亞麻薺
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 摘要10-12
• Abstract12-15
• 縮略詞表15-17
• 文獻(xiàn)綜述17-39
• 1 超長鏈脂肪酸的生物學(xué)功能及應(yīng)用17-20
• 1.1 超長鏈脂肪酸的生物學(xué)功能17-18
• 1.2 超長鏈脂肪酸的應(yīng)用18-20
• 1.2.1 芥酸的應(yīng)用價(jià)值18-19
• 1.2.2 神經(jīng)酸的應(yīng)用價(jià)值19-20
• 2 超長鏈脂肪酸的生物合成20-32
• 2.1 脂肪酸碳鏈延長酶23-28
• 2.1.1 KCS基因的研究進(jìn)展23-27
• 2.1.2 KCR基因的研究進(jìn)展27-28
• 2.1.3 HCD基因的研究進(jìn)展28
• 2.1.4 ECR基因的研究進(jìn)展28
• 2.2 三酰甘油的合成28-32
• 2.2.1 三酰甘油的生物合成28-31
• 2.2.2 LPAAT基因的研究進(jìn)展31-32
• 3 多基因聚合技術(shù)32
• 4 高超長鏈脂肪酸作物的育種進(jìn)展32-37
• 4.1 高芥酸育種進(jìn)展33-36
• 4.1.1 過表達(dá)FAE1 提高芥酸含量33
• 4.1.2 引入對芥酸具有親和力的LPAAT33-34
• 4.1.3 抑制FAD2 基因的表達(dá)為芥酸的合成提供足夠的底物34-36
• 4.2 高神經(jīng)酸育種進(jìn)展36-37
• 5 新興的油料作物——亞麻薺37-38
• 6 本研究的目的與意義38-39
• 第一章 甘藍(lán)型油菜BnaA.FAE1 與BnaC.FAE1 的克隆及其底物特異性的研究39-66
• 引言39
• 1 本研究的目的與意義39-40
• 2 材料和方法40-56
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料40-44
• 2.1.1 植物材料40
• 2.1.2 載體和菌株40
• 2.1.3 酶類40
• 2.1.4 生化試劑與耗材40-41
• 2.1.5 引物合成與測序分析41
• 2.1.6 軟件與數(shù)據(jù)分析41
• 2.1.7 實(shí)驗(yàn)儀器41
• 2.1.8 主要試劑的配制41-44
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法44-56
• 2.2.1 亞麻薺的生長條件44
• 2.2.2 擬南芥的生長條件44
• 2.2.3 植物種子總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄c DNA44-46
• 2.2.4 植物總DNA提取46-47
• 2.2.5 甘藍(lán)型油菜基因BnaA.FAE1 和BnaC.FAE1 的克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建47-52
• 2.2.6 亞麻薺的轉(zhuǎn)化及陽性種子的篩選52-53
• 2.2.7 擬南芥的轉(zhuǎn)化及陽性種子的篩選53-54
• 2.2.8 酵母的轉(zhuǎn)化54
• 2.2.9 脂肪酸組成的氣相色譜分析54-55
• 2.2.10 Acyl-CoAs的液相-質(zhì)譜分析55-56
• 3 結(jié)果與分析56-63
• 3.1 甘藍(lán)型油菜BnaA.FAE1 與BnaC.FAE1 的克隆及其序列差異性分析56-57
• 3.2 BnaA.FAE1 與BnaC.FAE1 在亞麻薺種子中特異表達(dá)對種子中脂肪酸組成的影響57-60
• 3.3 BnaA.FAE1 與BnaC.FAE1 轉(zhuǎn)基因的亞麻薺發(fā)育的種子中的Acyl-CoAs組成分析60-61
• 3.4 將BnaA.FAE1 與BnaC.FAE1 在擬南芥fad2/fae1 雙突變體中特異表達(dá)對其種子中脂肪酸組成的影響61-62
• 3.5 將BnaA.FAE1 與BnaC.FAE1 在酵母中異源表達(dá)對其脂肪酸組成的影響62-63
• 3.6 對白菜型油菜以及甘藍(lán)種子中的脂肪酸組成的分析63
• 4 討論63-65
• 5 本章小結(jié)65-66
• 第二章 甘藍(lán)型油菜BnFAE1 分子標(biāo)記開發(fā)以及高芥酸、低多不飽和脂肪酸甘藍(lán)型油菜的創(chuàng)建66-79
• 引言66-67
• 1 本研究的目的和意義67
• 2 材料和方法67-71
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料67-69
• 2.1.1 植物材料67-68
• 2.1.2 載體和菌株68
• 2.1.3 酶類68
• 2.1.4 生化試劑與耗材68
• 2.1.5 引物合成與測序分析68
• 2.1.6 軟件與數(shù)據(jù)分析68
• 2.1.7 實(shí)驗(yàn)儀器68
• 2.1.8 主要試劑的配置68-69
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法69-71
• 2.2.1 甘藍(lán)型油菜的田間種植及雜交組合69
• 2.2.2 高油酸甘藍(lán)型油菜BnFAE1 基因的克隆69-70
• 2.2.3 等位基因特異引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增70
• 2.2.4 脂肪酸組成的氣相色譜分析70-71
• 3 結(jié)果與分析71-77
• 3.1 高油酸甘藍(lán)型油菜親本中BnFAE1 基因的克隆及突變位點(diǎn)分析71-72
• 3.2 甘藍(lán)型油菜BnFAE1 的分子標(biāo)記開發(fā)72-74
• 3.3 高芥酸/低多不飽和脂肪酸的油菜單株篩選74-77
• 4 討論77-78
• 5 本章小結(jié)78-79
• 第三章 調(diào)控幾個(gè)芥酸合成關(guān)鍵基因?qū)τ筒朔N子中脂肪酸組成的影響79-108
• 引言79-80
• 1 本研究的目的與意義80
• 2 材料和方法80-97
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料80-82
• 2.1.1 植物材料80
• 2.1.2 載體和菌株80
• 2.1.3 酶類80-81
• 2.1.4 生化試劑與耗材81
• 2.1.5 引物合成與測序分析81
• 2.1.6 軟件與數(shù)據(jù)分析81
• 2.1.7 實(shí)驗(yàn)儀器81
• 2.1.8 主要試劑的配制81-82
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法82-97
• 2.2.1 甘藍(lán)型油菜的生長條件82
• 2.2.2 亞麻薺的生長條件82-83
• 2.2.3 基因克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建83-89
• 2.2.4 甘藍(lán)型油菜的遺傳轉(zhuǎn)化89-90
• 2.2.5 轉(zhuǎn)基因植株的PCR陽性鑒定90
• 2.2.6 亞麻薺的轉(zhuǎn)化及陽性種子的篩選90
• 2.2.7 轉(zhuǎn)基因植株的Southern分析90-94
• 2.2.8 轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)分析94-95
• 2.2.9 種子中脂肪酸組成分析95
• 2.2.10 三酰甘油中甘油骨架sn-2 位的脂肪酸組成分析95-97
• 3 結(jié)果與分析97-104
• 3.1 在甘藍(lán)型油菜種子中特異超表達(dá)BnFAE1 對其脂肪酸組成的影響97-99
• 3.2 在甘藍(lán)型油菜種子中特異抑制BnFAD2 的表達(dá)對其脂肪酸組成的影響99-101
• 3.3 將BnFAE1 超表達(dá)株系與BnFAD2 反義抑制株系雜交對其后代種子中脂肪酸組成的影響101
• 3.4 在甘藍(lán)型油菜中表達(dá)酵母SLC1 和SLC1-1 以及甘藍(lán)BoLPAAT對其種子中脂肪酸組成的影響101-102
• 3.5 在甘藍(lán)型油菜種子中共表達(dá)LdLPAAT、BnaA.FAE1 以及RNAi抑制BnLPAAT的表達(dá)對其脂肪酸組成的影響102-104
• 4 討論104-107
• 5 本章小結(jié)107-108
• 第四章 共表達(dá)脂肪酸碳鏈延長酶復(fù)合體不同成員基因?qū)ΤL鏈脂肪酸含量的影響108-131
• 引言108-109
• 1 本研究的目的和意義109
• 2 材料和方法109-114
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料109-111
• 2.1.1 植物材料109
• 2.1.2 載體和菌株109-110
• 2.1.3 酶類110
• 2.1.4 生化試劑與耗材110
• 2.1.5 引物合成與測序分析110
• 2.1.6 軟件與數(shù)據(jù)分析110
• 2.1.7 實(shí)驗(yàn)儀器110-111
• 2.1.8 主要試劑的配制111
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法111-114
• 2.2.1 亞麻薺的生長條件111
• 2.2.2 基因克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建111-113
• 2.2.3 亞麻薺的轉(zhuǎn)化及陽性種子的篩選113-114
• 2.2.4 轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)分析114
• 2.2.5 種子中脂肪酸組成分析114
• 2.2.6 Acyl-CoAs的液相-質(zhì)譜分析114
• 3 結(jié)果與分析114-127
• 3.1 脂肪酸碳鏈延長酶基因的各種組合的載體轉(zhuǎn)化亞麻薺114-115
• 3.2 在亞麻薺種子中僅異源表達(dá)LaKCS對其脂肪酸組成的影響115-116
• 3.3 在亞麻薺種子中At KCR、At HCD和At ECR中任意一個(gè)基因與LaKCS共表達(dá)對其脂肪酸組成的影響116-122
• 3.4 在亞麻薺種子中共表達(dá)LaKCS、At KCR和At HCD對其脂肪酸組成的影響122
• 3.5 各轉(zhuǎn)基因亞麻薺株系中Acyl-CoA的分析122-124
• 3.6 各轉(zhuǎn)基因亞麻薺株系發(fā)育種子中脂肪酸含量的動(dòng)態(tài)觀察124-127
• 4 討論127-130
• 5 本章小結(jié)130-131
• 參考文獻(xiàn)131-142
• 附錄142-145
• 附錄1142-144
• 附錄2 作者簡介和在讀期間發(fā)表的論文144-145
• 致謝145-147

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1133511