本文關(guān)鍵詞：一類新非編碼RNA的發(fā)現(xiàn)以及產(chǎn)生和功能的初探

  更多相關(guān)文章： 非編碼RNA 環(huán)RNA Alu元件 AG-GT序列 circEIF3J circPAIP2 拷貝數(shù) RNA二級結(jié)構(gòu)

【摘要】：非編碼RNA通過不同的路徑來調(diào)控基因表達(dá),它與許多生理活動和疾病有關(guān)。而環(huán)RNA作為非編碼RNA的一種,30多年前就被發(fā)現(xiàn)了,但是人們當(dāng)時只是把它當(dāng)作一類轉(zhuǎn)錄本在發(fā)生錯誤剪接和拼接過程中形式的垃圾RNA分子。直到2013年人們才認(rèn)識到環(huán)狀RNA在哺乳動物細(xì)胞中是普遍存在的,其中有一類環(huán)RNA序列當(dāng)中充滿了小RNA的結(jié)合位點,可起到“海綿”的作用,能夠在每個環(huán)RNA分子上結(jié)合大量的小RNA。已有的研究表明環(huán)狀RNA在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中扮演著一個重要角色,環(huán)RNA已成為目前分子生物學(xué)領(lǐng)域的國際熱點課題之一。本文正是在已有的關(guān)于環(huán)RNA研究的基礎(chǔ)上,從實驗上對環(huán)RNA進(jìn)行了深入和細(xì)致的研究,取得了以下重要的成果：(1)在研究與調(diào)控pol Ⅱ轉(zhuǎn)錄的非編碼RNA實驗中,發(fā)現(xiàn)一類新的環(huán)RNA。選取其中15個進(jìn)行實驗驗證。這類環(huán)RNA是不同于之前研究人員發(fā)現(xiàn)的。它是由外顯子-內(nèi)含子-外顯子構(gòu)成的,而連接部分必須是由兩個外顯子連接在一起的,中間是由內(nèi)含子構(gòu)成的。這類環(huán)RNA在不同細(xì)胞中表現(xiàn)出組織特異性。例如,CLTC mRNA在兩種細(xì)胞中都有表達(dá),但是circCLTC只在HeLa細(xì)胞中表達(dá),而在HEK293細(xì)胞中是不表達(dá)。同時,我們檢測了其中兩個CircEIF3J和CircPAIP2在HeLa細(xì)胞中的拷貝數(shù),分別大約為31個和22個。(2)對比這15個circular RNA的前后序列,發(fā)現(xiàn)其中有4個是有前后互補(bǔ)的Alu序列,還有4個雖然不是Alu序列,但是前后也有堿基互補(bǔ)的序列。通過構(gòu)建circEIF3J和circPAIP2的四種不同目的片段的環(huán)RNA質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染后來檢測這兩個環(huán)RNA在細(xì)胞和細(xì)胞核中的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)如果環(huán)RNA前后的互補(bǔ)序列越多,產(chǎn)生的circular RNA也越多,可能是這樣很容易構(gòu)成一個發(fā)卡結(jié)構(gòu),便于環(huán)RNA的剪切。但是我們卻發(fā)現(xiàn)這些人工構(gòu)建的circular RNA不會對它們parent基因的表達(dá)產(chǎn)生影響。(3)Alu元件作為為哺乳類動物所特有的的短散在元件,可能在對環(huán)RNA的產(chǎn)生過程當(dāng)中起到非常重要的作用。所以,構(gòu)建了一類全新環(huán)RNA質(zhì)粒,在人類細(xì)胞中是不可能自然產(chǎn)生的。通過實驗可以發(fā)現(xiàn)這四個質(zhì)粒也能夠產(chǎn)生環(huán)RNA的,但是跑膠的目的條帶卻是彌散的,推測是產(chǎn)生環(huán)RNA時剪切位點不同。(4)通過觀察發(fā)現(xiàn)這類環(huán)RNA的銜接位點兩端處都有AG-GT序列,這個序列是否對環(huán)RNA的產(chǎn)生或功能有影響了?構(gòu)建了兩批不同的質(zhì)粒,一類是以GFP為報告基因的,一類是熒光素酶為報告基因的。通過實驗發(fā)現(xiàn),AG-GT序列對環(huán)RNA的產(chǎn)生沒有影響,但是卻對它的功能在一定的條件下有影響。最后預(yù)測了CircEIF3J和CircPAIP2的二級結(jié)構(gòu),因為在許多非編碼RNA分子當(dāng)中,RNA的二級結(jié)構(gòu)對其正常功能的發(fā)揮有非常重要,有時候甚至于比序列重要。
【關(guān)鍵詞】：非編碼RNA 環(huán)RNA Alu元件 AG-GT序列 circEIF3J circPAIP2 拷貝數(shù) RNA二級結(jié)構(gòu)
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q522
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-13
• 第一章 非編碼RNA和長非編碼RNA13-25
• 1.1 引言13-14
• 1.2 非編碼RNA的分類14-17
• 1.3 非編碼RNA的功能和作用17-19
• 1.4 長非編碼RNA的簡介19-25
• 1.4.1 長非編碼RNA概述20-21
• 1.4.2 長非編碼RNA的功能和作用機(jī)制21-24
• 1.4.3 lncRNA在疾病中的作用相關(guān)研究24-25
• 第二章 circular RNA25-35
• 2.1 引言25
• 2.2 circular RNA研究歷史和現(xiàn)狀25-28
• 2.2.1 circular RNA的發(fā)現(xiàn)和鑒定25-26
• 2.2.2 circular RNA的主要特征26-27
• 2.2.3 circular RNA的長度27-28
• 2.3 circular RNA的功能28-33
• 2.3.1 circular RNA的發(fā)生機(jī)制28-29
• 2.3.2 CDR1as/CIRS-7作為的miR-7海綿(sponge)29-31
• 2.3.3 內(nèi)含子來源的circular RNA的功能31
• 2.3.4 circular RNA其他的可能功能和應(yīng)用前景31-33
• 2.4 circular RNA在疾病發(fā)生中的作用和功能33-35
• 第三章 實驗材料和方法35-63
• 3.1 實驗材料35-46
• 3.1.1 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞株35
• 3.1.2 主要儀器35-36
• 3.1.3 試劑和溶劑配制36-37
• 3.1.4 Primer和siRNA的設(shè)計序列37-46
• 3.2 實驗方法46-63
• 3.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇46
• 3.2.2 細(xì)胞傳代46-47
• 3.2.3 細(xì)胞凍存47-48
• 3.2.4 質(zhì)粒構(gòu)建48-54
• 3.2.5 T載構(gòu)建以及藍(lán)白斑篩選54
• 3.2.6 貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染54
• 3.2.7 細(xì)胞核提取54-55
• 3.2.8 RNA抽提55-56
• 3.2.9 DNase消化56-57
• 3.2.10 逆轉(zhuǎn)錄57-58
• 3.2.11 Quantitative reverse-transcription PCR58-59
• 3.2.12 luciferase熒光蛋白檢測59-60
• 3.2.13 western blot檢測 & protein blot60-63
• 第四章 結(jié)果和討論63-87
• 4.1 有一類circular RNA是和pol Ⅱ聯(lián)系在一起的63-72
• 4.1.1 驗證其中15個circular RNA64-68
• 4.1.2 circular RNA的表達(dá)存在細(xì)胞特異性68-69
• 4.1.3 circular RNA的序列中是有exon-intron-exon組成的69-70
• 4.1.4 circular RNA在細(xì)胞中的拷貝數(shù)70-72
• 4.2 circular RNA過表達(dá)情況研究72-77
• 4.2.1 對15個circular RNA的前后序列進(jìn)行比對72
• 4.2.2 四種circular RNA過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建72-74
• 4.2.3 四種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,在細(xì)胞中過表達(dá)circular RNA的情況74-76
• 4.2.4 四種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,在HEK293細(xì)胞核中過表達(dá)circular RNA的情況76
• 4.2.5 四種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,過表達(dá)的circular RNA對parent gene的表達(dá)影響76-77
• 4.3 ALU元件對circular RNA的影響77-80
• 4.3.1 構(gòu)建含有alu序列的質(zhì)粒,檢測是否成環(huán)77-79
• 4.3.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,表達(dá)的circular RNA對報告基因的表達(dá)影響79-80
• 4.4 circular RNA的junction部分有AG-GT堿基對環(huán)功能的影響80-83
• 4.4.1 構(gòu)建有無AG-GT序列的質(zhì)粒80
• 4.4.2 第二批質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,在HEK293細(xì)胞核中過表達(dá)circular RNA的情況80-81
• 4.4.3 第一批質(zhì)粒當(dāng)中,AG-GT對報告基因GFP的表達(dá)影響81-82
• 4.4.4 第二批質(zhì)粒當(dāng)中,AG-GT對報告基因luciferase蛋白的表達(dá)影響82-83
• 4.5 circular RNA的二級結(jié)構(gòu)83-84
• 4.6 討論和結(jié)論84-87
• 第五章 總結(jié)和展望87-91
• 參考文獻(xiàn)91-103
• 博士期間發(fā)表的論文103-105
• 致謝105

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