本文關鍵詞：柵藻（Scenedesmus obliquus）的藻菌共生體系的構(gòu)建及調(diào)控

  更多相關文章： 產(chǎn)油微藻 藻菌共生體系 胞外多聚物 微生物群落 開放培養(yǎng)

【摘要】：由于光合效率高、生長速度快、含油量高等特性,微藻被認為是最有希望替代化石能源的生物質(zhì)能源。開放池培養(yǎng)是實現(xiàn)微藻規(guī)�；囵B(yǎng)的主要方式,但如何提高產(chǎn)油微藻在開放體系中培養(yǎng)的穩(wěn)定性,增強抵御外界物種侵擾的能力以及進一步提高微藻生物量產(chǎn)率成為限制微藻生物柴油產(chǎn)業(yè)化的瓶頸。微藻與微生物的共生體系可以為微藻的生長提供良好的微環(huán)境,但目前有關微藻-微生物共生體系中微藻生長和油脂積累特性的研究仍然比較缺乏。木論文以一株產(chǎn)油微藻斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)為研究對象,通過人工構(gòu)建藻菌共生體系,研究了該體系在自養(yǎng)條件下對柵藻的生長和油脂積累特性的影響及機制,并進一步探索了藻菌共生體系在開放條件下的穩(wěn)定性和抵御外界物種侵擾的能力。構(gòu)建了柵藻與真核生物的共生體系(即共培養(yǎng)體系)。當假絲酵母Candida tropicalis和釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae分別與純化后的斜生柵藻共培養(yǎng)時,只有前者可以增加柵藻的生物量、光合活性和油脂含量,它們分別比純柵藻體系提高了30.3%、61%和22.5%。相反,釀酒酵母則無顯著效應。不同初始接種比例的研究結(jié)果表明,柵藻和C. tropicalis的接種比例為3：1時,C. tropicalis對柵藻生長的促進效應最顯著。C. tropicalis的存在可以消耗上清液中的胞外多聚物(EPS)和溶解氧,從而減輕它們對微藻生長的抑制作用。此外,柵藻和C. tropicalis的共培養(yǎng)僅在無雜菌的封閉式光反應器中可以促進微藻生長并提高其油脂積累能力,在開放條件下,該促進效應并不顯著。構(gòu)建了柵藻與原核生物的共培養(yǎng)體系。對未純化的柵藻在正常培養(yǎng)過程中細菌菌群的分析表明,有益菌群和有害菌群共同存在于培養(yǎng)體系中。從柵藻培養(yǎng)液中共篩選到5株與柵藻共生的有益菌菌株,它們分別屬于不同的種屬,包括Brevundimonas aurantiaca(菌株2-1),Rhizobium sp(菌株2-2),Pseudomonas sp(菌株3-4), Acidovorax facilis(菌株3-10)和Diaphorobacter sp.(菌株3-11)。將5株菌株分別與柵藻共培養(yǎng)10天后發(fā)現(xiàn),它們均可以顯著提高柵藻的生物量。其中菌株3-10的效果最好,使柵藻生物量增加了24.8%。同時,細菌的存在提高了柵藻油脂的含量,增加了飽和脂肪酸和十八烯酸的比例,降低了不飽和脂肪酸的比例。掃描電鏡的結(jié)果表明在藻菌共培養(yǎng)體系中,細菌附著在柵藻的表而,這更有利于二者的物質(zhì)交換。對已構(gòu)建的微藻-細菌共培養(yǎng)體系進行調(diào)控,研究初始接種比例、外源金屬離子濃度、缺氮條件以及細菌菌株組合對柵藻生物量、油脂含量和EPS含量的影響。當初始藻菌比例為3：1時,細菌對柵藻生長的促進效果最顯著。EPS是藻菌體系調(diào)控的核心,外源添加CaCl2的濃度為100 mg/L時,顯著提高了藻菌體系EPS中蛋白質(zhì)和多糖的含量,并且CaCl2的添加并不影響柵藻的生長和油脂含量。在缺氮誘導的條件下,藻菌體系中柵藻的油脂含量和產(chǎn)率最高比純柵藻體系分別提高了33.3%和73.9%。不同菌株的組合結(jié)果表明,菌株2-2,3-4,3-10和3-11的組合效果最顯著,可以使柵藻的生物量和油脂含量分別增加28.5%和14.6%。利用Applikon微型反應器研究了柵藻與細菌之間的氣體和物質(zhì)交換,揭示藻菌體系的共生機制。證實細菌的參與可以降低培養(yǎng)系統(tǒng)中的溶解氧,促進柵藻生長,后者又進一步消耗二氧化碳,釋放氧氣,利于細菌生長,從而形成柵藻與細菌之間氣體交換的循環(huán)。證實細菌可以降低EPS(包括結(jié)合型和游離型)中大分子量化合物以及總有機碳的含量,增加體系中總無機碳的含量,為柵藻的光合作用提供原料。共生體系中柵藻胞外微環(huán)境的改變也促使柵藻將胞內(nèi)的總糖轉(zhuǎn)化為油脂,這些最終促使了柵藻油脂含量的提高。最后,考察了開放條件下藻菌共生體系中柵藻的生物量和油脂積累情況以及該體系的穩(wěn)定性。經(jīng)過16天的培養(yǎng),開放條件下藻菌體系中柵藻的生物量比封閉條件的純柵藻體系提高了17.1%,比開放條件的純柵藻體系提高了95%,同時,藻菌體系中柵藻的油脂含量比純柵藻封閉體系也增加了24%。微生物群落的分析結(jié)果證實,藻菌體系中的細菌菌群保持穩(wěn)定,初始接種的菌種在培養(yǎng)過程中(12天)始終是優(yōu)勢菌群。相反,純柵藻體系在開放條件下其細菌菌群發(fā)生了明顯改變,小豐度菌種的比例在培養(yǎng)后期增加到40%。僅在純柵藻的開放培養(yǎng)體系中檢測到有害微型動物,Colpodea(腎形蟲屬)和Platyophrya(匙口蟲屬)。可見,藻菌共生體系可以增強微藻培養(yǎng)體系在開放條件下的穩(wěn)定性,減少有害物種的入侵。
【關鍵詞】：產(chǎn)油微藻 藻菌共生體系 胞外多聚物 微生物群落 開放培養(yǎng)
【學位授予單位】：中國科學院研究生院(過程工程研究所)
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q949.2;TE667
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-16
• 前言16-18
• 1 文獻綜述18-36
• 1.1 微藻概述18-20
• 1.1.1 微藻的定義18
• 1.1.2 微藻的應用18-20
• 1.2 微藻的培養(yǎng)20-24
• 1.2.1 微藻培養(yǎng)的環(huán)境因素20-22
• 1.2.2 微藻培養(yǎng)系統(tǒng)22-24
• 1.2.2.1 封閉式光生物反應器22-23
• 1.2.2.2 開放式光生物反應器23-24
• 1.3 藻菌共生體系24-33
• 1.3.1 共生的概念及主要形式25-26
• 1.3.2 藻菌共生體系26-33
• 1.3.2.1 藻菌共生體系促進微藻的生長和培養(yǎng)體系的穩(wěn)定26-28
• 1.3.2.2 藻菌共生體系對難降解物質(zhì)和金屬離子的去除28-29
• 1.3.2.3 微藻培養(yǎng)過程中微生物種群的變化29-30
• 1.3.2.4 人工混合菌群30-33
• 1.4 本論文的研究思路33-36
• 2 柵藻和酵母菌共培養(yǎng)對柵藻生長和油脂積累的影響36-54
• 2.1 引言36
• 2.2 材料和方法36-41
• 2.2.1 主要實驗儀器36-37
• 2.2.2 藻種和培養(yǎng)基37
• 2.2.3 分析方法37-41
• 2.2.3.1 無菌柵藻(純柵藻)的分離和純化37
• 2.2.3.2 微藻生物量的測定37-38
• 2.2.3.3 微藻細胞葉綠索a含量的測量38
• 2.2.3.4 微藻光和活性的檢測38
• 2.2.3.5 微藻比生長速率38
• 2.2.3.6 微藻二氧化碳固定速率38-39
• 2.2.3.7 胞外多聚物含量的檢測39
• 2.2.3.8 微藻油脂含量和油脂脂肪酸組成的檢測39
• 2.2.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析39-40
• 2.2.3.10 實驗設計40-41
• 2.3 結(jié)果和討論41-52
• 2.3.1 酵母菌對柵藻生長的影響41-43
• 2.3.2 酵母菌對柵藻光合活性的影響43-45
• 2.3.3 柵藻和酵母菌初始接種比例對柵藻生長的影響45-49
• 2.3.4 柵藻和C.tropicalis共培養(yǎng)過程中胞外多聚物含量的變化49-50
• 2.3.5 柵藻和C.tropicalis共培養(yǎng)體系中柵藻油脂含量和脂肪酸組成50-51
• 2.3.6 開放條件下柵藻和C.tropicalis共培養(yǎng)體系中柵藻的生長51-52
• 2.4 小結(jié)52-54
• 3 柵藻藻菌共生體系的構(gòu)建及其生長和油脂積累特性54-82
• 3.1 引言54
• 3.2 材料和方法54-59
• 3.2.1 主要實驗儀器54
• 3.2.2 實驗設計54-55
• 3.2.3 藻種、菌種和培養(yǎng)基55
• 3.2.4 分析方法55-59
• 3.2.4.1 柵藻培養(yǎng)過程中微生物群落的變化55-56
• 3.2.4.2 柵藻培養(yǎng)液中可培養(yǎng)細菌的篩選和鑒定56
• 3.2.4.3 無菌柵藻(純柵藻)的分離和純化56
• 3.2.4.4 篩選能夠利用柵藻分泌物的微生物56-57
• 3.2.4.5 構(gòu)建純柵藻與細菌的共培養(yǎng)體系57
• 3.2.4.6 細菌生物量的測定57
• 3.2.4.7 柵藻生物量的測定57
• 3.2.4.8 環(huán)境掃描電鏡觀察柵藻及其共生菌57-58
• 3.2.4.9 微藻比生長速率58
• 3.2.4.10 胞外多聚物含量的檢測58
• 3.2.4.11 胞外多聚物中氨基酸和單糖組成的檢測58-59
• 3.2.4.12 柵藻油脂含量和脂肪酸組成的檢測59
• 3.2.4.13 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析59
• 3.3 結(jié)果和討論59-79
• 3.3.1 柵藻培養(yǎng)過程中微生物群落的變化59-64
• 3.3.2 無菌柵藻(純柵藻)的分離和純化64-65
• 3.3.3 純柵藻和未純化柵藻的生長特性65-66
• 3.3.4 未純化柵藻中可培養(yǎng)微生物的篩選、純化與鑒定66-68
• 3.3.5 可利用柵藻胞外多聚物的微生物的篩選68-69
• 3.3.6 人工構(gòu)建藻菌共生體系中柵藻的生長特性69-73
• 3.3.7 藻菌共生體系中胞外多聚物的含量和組成73-78
• 3.3.8 藻菌體系中柵藻的油脂含量以及脂肪酸組成78-79
• 3.4 小結(jié)79-82
• 4 柵藻藻菌共生體系的調(diào)控82-104
• 4.1 引言82-83
• 4.2 材料和方法83-86
• 4.2.1 藻種、菌種和培養(yǎng)基83
• 4.2.2 分析方法83-84
• 4.2.2.1 定量PCR檢測微藻和細菌的生物量83
• 4.2.2.2 柵藻生物量測定83
• 4.2.2.3 胞外多聚物含量檢測83
• 4.2.2.4 柵藻油脂含量和脂肪酸組成83-84
• 4.2.2.5 樣品中金屬元素的檢測84
• 4.2.3 實驗設計84-86
• 4.2.3.1 不同初始比例的柵藻/細菌對柵藻生長和油脂積累的影響84
• 4.2.3.2 基于胞外多聚物調(diào)控藻菌共生體系84-85
• 4.2.3.3 缺氮調(diào)節(jié)藻菌體系中微藻的油脂積累85
• 4.2.3.4 多菌種組合對柵藻生長和油脂積累的影響85-86
• 4.2.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析86
• 4.3 實驗結(jié)果和討論86-101
• 4.3.1 不同初始接種比例對柵藻生長和油脂積累的影響86-88
• 4.3.2 基于胞外多聚物通過添加金屬離子調(diào)控藻菌體系88-93
• 4.3.3 缺氮調(diào)節(jié)藻菌體系中微藻的油脂積累93-98
• 4.3.4 多菌種組合對柵藻生長和油脂積累的影響98-101
• 4.4 小結(jié)101-104
• 5 藻菌共生體系的共生機制研究104-120
• 5.1 前言104
• 5.2 材料和方法104-106
• 5.2.1 Applikon微型反應器104-105
• 5.2.2 實驗設計105
• 5.2.3 分析方法105-106
• 5.2.3.1 胞外多聚物分子量的測定105
• 5.2.3.2 胞外多聚物中總有機碳(TOC)和總無機碳(TIC)的測定105-106
• 5.2.3.3 胞外多聚物含量的檢測106
• 5.2.3.4 胞外多聚物中氨基酸和單糖組成的檢測106
• 5.2.3.5 通過定量PCR檢測微藻和細菌的生物量106
• 5.2.3.6 柵藻油脂含量和脂肪酸組成106
• 5.2.3.7 柵藻胞內(nèi)蛋白含量的測定106
• 5.2.3.8 柵藻胞內(nèi)總糖含量的測定106
• 5.3 結(jié)果和討論106-117
• 5.3.1 藻菌共生體系中O_2和CO_2的變化106-111
• 5.3.2 藻菌共生體系中胞外多聚物的變化111-113
• 5.3.3 藻菌共生體系中柵藻胞內(nèi)化合物含量的變化113-116
• 5.3.4 藻菌共生體系的共生機制116-117
• 5.4 小結(jié)117-120
• 6 人工構(gòu)建藻菌體系在開放條件下的培養(yǎng)效果120-134
• 6.1 引言120
• 6.2 材料和方法120-122
• 6.2.1 實驗設計120-121
• 6.2.2 光生物反應器121
• 6.2.3 分析方法121-122
• 6.2.3.1 柵藻生物量的檢測121
• 6.2.3.2 胞外多聚物含量的檢測121
• 6.2.3.3 柵藻油脂含量的檢測121-122
• 6.2.3.4 微生物群落的檢測122
• 6.2.3.5 微藻葉綠素含量的檢測122
• 6.2.3.6 微藻光和活性的檢測122
• 6.3 結(jié)果與討論122-131
• 6.3.1 開放條件下藻菌共生體系中柵藻的生長和油脂含量122-125
• 6.3.2 開放條件下藻菌共生體系中微生物群落的變化125-129
• 6.3.3 開放條件下藻菌共生體系中胞外多聚物含量的變化129-131
• 6.4 小結(jié)131-134
• 7 結(jié)論與展望134-138
• 7.1 結(jié)論134-136
• 7.2 展望136-138
• 參考文獻138-148
• 附錄A 個人簡歷及發(fā)表文章目錄148-150
• 致謝150

【參考文獻】

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1 劉天中;張維;王俊峰;郎瑩;張靜;;微藻規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)研究進展[J];生命科學;2014年05期

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本文編號：1030686