本文關(guān)鍵詞：GAPCs在細(xì)胞自噬和植物免疫中的功能研究

  更多相關(guān)文章： 細(xì)胞自噬 GAPCs ATG3 ROS 細(xì)胞死亡

【摘要】：細(xì)胞自噬是保守的細(xì)胞內(nèi)代謝途徑,參與多種生理過程,例如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)循環(huán)、發(fā)育、衰老、非生物逆境脅迫和抗病反應(yīng)等。在植物中,細(xì)胞自噬能夠受到活性氧(ROS)誘導(dǎo)而上調(diào),參與脅迫相關(guān)的氧化蛋白的降解過程。目前并不清楚細(xì)胞自噬響應(yīng)氧化脅迫受ROS調(diào)控的機(jī)制。ATG3蛋白是參與細(xì)胞自噬重要的酶,催化關(guān)鍵步驟ATG8的脂化。植物中ATG3不僅是細(xì)胞自噬通路中的關(guān)鍵組分,也參與免疫相關(guān)的細(xì)胞死亡的調(diào)控。本論文通過標(biāo)簽純化串聯(lián)質(zhì)譜鑒定策略篩選ATG3在植物體內(nèi)的互作蛋白,并通過生理、生化和遺傳實(shí)驗(yàn)研究ATG3互作蛋白參與細(xì)胞自噬和影響植物抗病反應(yīng)的分子機(jī)制。植物中,胞質(zhì)定位的三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPCs)有多個(gè)同源蛋白,除了在糖酵解中發(fā)揮生化酶活功能外,也參與胚胎發(fā)育、花粉管發(fā)育、根系生長(zhǎng)、脂類代謝、種子油脂積累、ABA信號(hào)傳導(dǎo)和ROS信號(hào)傳導(dǎo)等其他多種生理過程。本論文首先鑒定了本生煙草中與ATG3互作的蛋白GAPCs。使用體內(nèi)、體外多種互作實(shí)驗(yàn)證明了ATG3與GAPCs的特異互作。同時(shí),我們發(fā)現(xiàn)氧化脅迫能夠抑制ATG3與GAPCs的互作。沉默GAPCs能夠組成型激活A(yù)TG3依賴的細(xì)胞自噬。瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)顯示,ATG3的過表達(dá)能夠在煙草中激活細(xì)胞自噬,GAPCs的過表達(dá)可以抑制ATG3過表達(dá)誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬;同樣,過表達(dá)GAPCs也可以抑制ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。另外,本論文研究了GAPCs在植物的免疫反應(yīng)中的作用。沉默GAPCs可以增強(qiáng)N基因介導(dǎo)的細(xì)胞死亡,增強(qiáng)植物對(duì)不親和病原Tobacco mosaic virus(TMV)和Pseudomonas syringae pvtomato DC3000(Pst DC3000)的抗性,同時(shí)還能增強(qiáng)煙草對(duì)親和病原細(xì)菌P.syringae pv tabaci的抗性。本文揭示了ATG3互作蛋白GAPCs在細(xì)胞自噬和植物免疫反應(yīng)中具有的多種作用。
【關(guān)鍵詞】：細(xì)胞自噬 GAPCs ATG3 ROS 細(xì)胞死亡
【學(xué)位授予單位】：清華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q946
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-11
• 第1章 前言11-27
• 1.1 細(xì)胞自噬11
• 1.2 植物細(xì)胞自噬的分子機(jī)制11-16
• 1.2.1 參與植物細(xì)胞自噬的保守基因11-13
• 1.2.2 參與細(xì)胞自噬的形成的蛋白組分13-16
• 1.3 植物細(xì)胞自噬的生理功能16-23
• 1.3.1 植物細(xì)胞自噬在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中的功能16-17
• 1.3.2 植物細(xì)胞自噬在植物的衰老中的功能17-18
• 1.3.3 植物細(xì)胞自噬在植物響應(yīng)非生物脅迫中的功能18-20
• 1.3.4 植物細(xì)胞自噬在植物響應(yīng)生物脅迫中的功能20-23
• 1.4 GAPDH是重要的多功能蛋白23-24
• 1.5 植物中GAPDH的功能研究24-27
• 第2章 材料與方法27-45
• 2.1 植物材料和生長(zhǎng)條件27
• 2.2 載體構(gòu)建27-29
• 2.2.1 功能載體的構(gòu)建27-28
• 2.2.2 LIC載體構(gòu)建28-29
• 2.3 培養(yǎng)基29
• 2.4 堿裂解法提取質(zhì)粒29
• 2.5 植物DNA的提取29-30
• 2.6 瓊脂糖凝膠回收純化DNA30
• 2.7 大腸桿菌感受態(tài)的制備30
• 2.8 大腸桿菌的熱激轉(zhuǎn)化30-31
• 2.9 農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)的制備31
• 2.10 農(nóng)桿菌感受態(tài)的凍融轉(zhuǎn)化31
• 2.11 免疫雜交31-32
• 2.12 煙草總蛋白Pull Down及互作蛋白質(zhì)譜鑒定32-34
• 2.12.1 煙草總蛋白Pull Down32
• 2.12.2 SDS-PAGE膠蛋白電泳32
• 2.12.3 銀染32-33
• 2.12.4 膠內(nèi)酶切33
• 2.12.5 質(zhì)譜鑒定分析33-34
• 2.13 熒光素酶互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)34
• 2.14 蛋白表達(dá)驗(yàn)證以及免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)34-35
• 2.15 體外互作驗(yàn)證（Pull-down）實(shí)驗(yàn)35-36
• 2.16 雙分子熒光互補(bǔ)（BiFC）實(shí)驗(yàn)36
• 2.17 細(xì)胞自噬觀察36-37
• 2.17.1 CFP-NbATG8f分子標(biāo)記觀察36
• 2.17.2 MDC染色36-37
• 2.17.3 電鏡觀察37
• 2.17.4 細(xì)胞自噬小體的計(jì)數(shù)37
• 2.18 植物RNA提取、反轉(zhuǎn)錄PCR和實(shí)時(shí)定量PCR37-38
• 2.19 MV注射38
• 2.20 ROS檢測(cè)38-39
• 2.20.1 NBT染色38-39
• 2.20.2 DAB染色39
• 2.21 病毒誘導(dǎo)基因沉默（VIGS）39
• 2.22 病毒侵染及熒光拍照39-40
• 2.23 病原菌生長(zhǎng)檢測(cè)40
• 2.24 細(xì)胞死亡實(shí)驗(yàn)40-41
• 2.24.1 細(xì)胞死亡誘導(dǎo)40
• 2.24.2 臺(tái)盼藍(lán)染色觀察40-41
• 2.25 引物序列41-45
• 第3章 ATG3體內(nèi)互作蛋白的篩選45-50
• 3.1 本章引言45
• 3.2 結(jié)果與分析45-48
• 3.2.1 ATG3體內(nèi)互作蛋白篩選與分類45-47
• 3.2.2 GAPC是ATG3特異的互作蛋白之一47-48
• 3.3 討論48-50
• 第4章 ROS負(fù)調(diào)控GAPCs與ATG3互作50-62
• 4.1 本章引言50
• 4.2 結(jié)果與分析50-61
• 4.2.1 GAPCs與ATG3均主要定位在胞質(zhì)50-51
• 4.2.2 GAPCs與ATG3存在體內(nèi)互作51-53
• 4.2.3 GAPCs與ATG3存在體外直接互作53-54
• 4.2.4 GAPCs與ATG3互作位于胞質(zhì)中54-57
• 4.2.5 GAPCs與ATG3互作受ROS負(fù)調(diào)控57-61
• 4.3 討論61-62
• 第5章 沉默GAPCs激活細(xì)胞自噬62-72
• 5.1 本章引言62-63
• 5.2 結(jié)果分析63-71
• 5.2.1 本生煙草中沉默GAPCs載體構(gòu)建和表型觀察63
• 5.2.2 VIGS基因沉默效率檢測(cè)63-66
• 5.2.3 在本生煙中沉默GAPCs能夠激活細(xì)胞自噬66-69
• 5.2.4 gapc擬南芥突變體中能夠觀察到細(xì)胞自噬激活69-71
• 5.3 討論71-72
• 第6章 GAPCs負(fù)調(diào)控ATG3以及ROS誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬72-82
• 6.1 本章引言72
• 6.2 結(jié)果與分析72-81
• 6.2.1 過表達(dá)ATG3可以激活細(xì)胞自噬72-76
• 6.2.2 過表達(dá)GAPCs可以抑制ATG3激活的細(xì)胞自噬76-77
• 6.2.3 過表達(dá)GAPCs可以抑制ROS激活的細(xì)胞自噬77-80
• 6.2.4 MV處理不影響ATG3的mRNA水平80-81
• 6.3 討論81-82
• 第7章 GAPCs參與植物免疫反應(yīng)82-88
• 7.1 本章引言82
• 7.2 結(jié)果與分析82-86
• 7.2.1 沉默GAPCs導(dǎo)致N基因介導(dǎo)的本生煙對(duì)TMV-GFP抗性增加82-83
• 7.2.2 沉默GAPCs導(dǎo)致N基因介導(dǎo)的HR細(xì)胞死亡加速83-84
• 7.2.3 沉默GAPCs導(dǎo)致對(duì)寄主病原細(xì)菌的抗性增加84
• 7.2.4 沉默GAPCs導(dǎo)致對(duì)非寄主病原細(xì)菌的抗性增加84-85
• 7.2.5 沉默GAPCs不影響非寄主抗性導(dǎo)致的細(xì)胞死亡85-86
• 7.3 討論86-88
• 第8章 討論與展望88-94
• 8.1 討論88-93
• 8.1.1 ATG3-GAPCs互作在細(xì)胞自噬中的作用88-91
• 8.1.2 GAPCs在植物抗病性中的作用91-93
• 8.2 仍待解決的科學(xué)問題93-94
• 第9章 其他研究工作94-104
• 9.1 本章引言94
• 9.2 結(jié)果與討論94-104
• 9.2.1 3IP2s主要定位在胞質(zhì)94-96
• 9.2.2 3IP2s能夠與ATG3在本生煙草中互作96-98
• 9.2.3 ATG3與 3IP2s互作位于胞質(zhì)中98
• 9.2.4 沉默 3IP2s導(dǎo)致依賴于ATG3的細(xì)胞自噬激活98-100
• 9.2.5 沉默 3IP2s導(dǎo)致葉綠體形態(tài)受損100-101
• 9.2.6 過表達(dá) 3IP2s導(dǎo)致葉綠體降解加速101-104
• 參考文獻(xiàn)104-114
• 致謝114-115
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果115-116

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