本文關鍵詞：大腸桿菌基因組編輯新方法及其在脂肪醇代謝工程應用的研究

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【摘要】：脂肪醇廣泛應用于化工、再生能源、醫(yī)藥等領域。近年來微生物發(fā)酵法生產脂肪醇的研究眾多,已經初步實現(xiàn)了這類物質的可再生合成方法。然而,目前微生物發(fā)酵生產脂肪醇存在產量低、菌種改造緩慢、檢測過程繁瑣、代謝路徑選擇不合理等問題,嚴重制約了脂肪醇化合物的發(fā)酵法生產和工業(yè)化進程。本論文從化合物的理化性質、生理毒性、菌種改造手段、代謝路徑優(yōu)化等方面出發(fā),提供了高效準確的基因組改造方法、簡單快速的檢測方法、構建了一系列脂肪醇高產的大腸桿菌工程菌,為實現(xiàn)大腸桿菌高產脂肪醇的“生物制造”奠定了基礎。首先,本論文利用了大腸桿菌高頻自發(fā)斷裂和斷裂后的同源重組修復機制,設計并實現(xiàn)了依靠正向重復序列輔助的大腸桿菌無痕編輯方法,命名為TRAGE.對可能影響TRAGE操作效率的因素(蔗糖加入節(jié)點、傳代次數(shù)、傳代時期)進行了系統(tǒng)考察,建立并優(yōu)化了TRAGE操作流程,最終實現(xiàn)60小時內完成基因組的無痕編輯。其次,本論文利用正交試驗優(yōu)化了發(fā)酵液中脂肪醇和脂肪酸的提取方法,確定了提取條件,萃取劑是乙酸乙酯,溶劑和樣品比例為1.2,搖床溫度為10℃、轉速260 rpm的條件下提取2 mmin。此外本論文建立了基于HPLC-RID的脂肪醇和脂肪酸的分析方法。利用C18色譜柱,流動相為甲醇：水：乙酸(90：9.9：0.1,v/v/v),流速為1.0 mL/min。驗證試驗顯示標品線性良好(r2≥0.9989),日間和日內相對標準偏差分別小于4.46%和5.38%,證明該方法具有良好的重復性和準確度。再次,本論文提出了采用誘發(fā)脂肪酸饑餓促進脂肪醇積累的思路,并證明了其可行性。在利用TRAGE敲除大腸桿菌所有已知酯解酶基因的基礎上,過量表達外源脂酰-ACP還原酶,使脂肪醇的積累量較改造前增加了1.4倍。在此基礎上,本研究通過敲除副產物合成路徑,降低有毒副產物產生,將脂肪醇的產量提高至6.33 g/L。此外,本論文首次利用RBS計算手段輔助設計脂肪醇合成路徑上的相關基因的RBS位點,利用所開發(fā)TRAGE完成了對fabH、fabZ RBS區(qū)域的改造,最終結合發(fā)酵過程優(yōu)化使得脂肪醇的產量達到9.35 g/L。
【關鍵詞】：脂肪醇 基因組編輯 酯解酶 脂肪酸饑餓 合成生物學
【學位授予單位】：中國科學院研究生院(過程工程研究所)
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：TQ923
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-15
• 1 文獻綜述15-31
• 1.1 引言15
• 1.2 基因組編輯方法15-19
• 1.2.1 依賴Cre/loxP和Flp/FRT基因組編輯15-17
• 1.2.2 通過“pop-in/pop-out”實現(xiàn)的基因組無痕編輯17
• 1.2.3 依賴識別特定序列的核酸酶的基因組編輯技術17-19
• 1.3 重組微生物生產脂肪酸及衍生生物燃料的代謝工程19-25
• 1.3.1 脂肪酸和脂肪醇分析方法19-20
• 1.3.2 微生物生產生物燃料的研究進展20-22
• 1.3.3 大腸桿菌生產脂肪醇的研究進展22-25
• 1.4 合成生物學應用于大腸桿菌代謝工程25-28
• 1.4.1 合成啟動子應用于大腸桿菌代謝工程25-26
• 1.4.2 密碼子優(yōu)化應用于大腸桿菌代謝工程26-27
• 1.4.3 RBS計算應用于大腸桿菌代謝工程27-28
• 1.5 本論文研究的目的及工作設想28-31
• 2 串聯(lián)重復序列輔助的大腸桿菌基因組編輯方法31-55
• 2.1 引言31-32
• 2.2 實驗材料32-38
• 2.2.1 試劑與儀器32-34
• 2.2.2 引物、菌株和質粒34-37
• 2.2.3 培養(yǎng)基37-38
• 2.2.4 主要溶液38
• 2.3 試驗方法38-48
• 2.3.1 大腸桿菌熱激感受態(tài)的制備與轉化38-39
• 2.3.2 大腸桿菌電轉化感受態(tài)的制備與轉化39-40
• 2.3.3 抗性標記基因的刪除40
• 2.3.4 基因組無痕編輯40-46
• 2.3.4.1 cat-sacB片段制備40-41
• 2.3.4.2 基因無痕敲除41-42
• 2.3.4.3 基因無痕替換42-44
• 2.3.4.4 基因無痕插入44-46
• 2.3.5 基因組無痕編輯過程的優(yōu)化46-48
• 2.3.5.1 蔗糖加入時刻的優(yōu)化46-47
• 2.3.5.2 在蔗糖培養(yǎng)基中傳代次數(shù)的優(yōu)化47
• 2.3.5.3 轉接時間的優(yōu)化47-48
• 2.4 結果與討論48-53
• 2.4.1 cat-sacB片段的構建48
• 2.4.2 基因刪除48-50
• 2.4.3 基因替換和插入50-51
• 2.4.4 基因組無痕編輯過程的優(yōu)化51-53
• 2.4.4.1 蔗糖加入時刻對重組率的影響51-52
• 2.4.4.2 傳代次數(shù)對重組率的影響52-53
• 2.4.4.3 傳代時刻對重組率的影響53
• 2.5 小結53-55
• 3 發(fā)酵液中脂肪酸和脂肪醇的分析55-75
• 3.1 引言55
• 3.2 材料和方法55-58
• 3.2.1 試劑與儀器55-57
• 3.2.2 菌株和質粒57
• 3.2.3 培養(yǎng)基57-58
• 3.3 試驗方法58-62
• 3.3.1 標準品的準備58
• 3.3.2 液相分析方法的優(yōu)化58-60
• 3.3.2.1 流動相比例的優(yōu)化58-59
• 3.3.2.2 流動相流速的優(yōu)化59
• 3.3.2.3 色譜柱溫度的優(yōu)化59-60
• 3.3.3 標準曲線和檢測線的測定60
• 3.3.4 提取方法的優(yōu)化60-61
• 3.3.5 分析方法的準確性和實用性分析61-62
• 3.3.5.1 提取方法加樣回收率分析61
• 3.3.5.2 分析方法穩(wěn)定性分析61-62
• 3.3.5.3 分析方法實用性分析62
• 3.4 結果與討論62-74
• 3.4.1 HPLC-RID的參數(shù)選擇62-65
• 3.4.1.1 流動相組成63-64
• 3.4.1.2 流速對檢測結果的影響64
• 3.4.1.3 柱溫對檢測結果的影響64-65
• 3.4.2 標準品的測定65-66
• 3.4.3 利用正交試驗優(yōu)化提取過程66-70
• 3.4.4 分析方法應用分析70-74
• 3.4.4.1 加樣回收率測定70-71
• 3.4.4.2 分析方法穩(wěn)定性檢驗71-72
• 3.4.4.3 分析方法應用研究72-74
• 3.5 小結74-75
• 4 脂肪酸饑餓強化脂肪醇合成75-91
• 4.1 引言75-76
• 4.2 材料和方法76-80
• 4.2.1 試劑與儀器76-78
• 4.2.2 本章所用引物、菌株和質粒78-79
• 4.2.3 培養(yǎng)基79-80
• 4.3 試驗方法80-82
• 4.3.1 海洋桿菌基因組的制備80
• 4.3.2 脂酰還原酶表達載體的構建80-81
• 4.3.3 副產物代謝路徑基因的刪除81
• 4.3.4 發(fā)酵菌株的構建81-82
• 4.3.5 酯解酶刪除對菌體生長的影響的測定82
• 4.3.6 酯解酶刪除對菌體轉錄組的影響測定82
• 4.3.7 工程菌株搖瓶發(fā)酵和脂肪醇產量檢測82
• 4.3.8 最優(yōu)菌株發(fā)酵罐發(fā)酵和脂肪醇產量的檢測82
• 4.4 結果與討論82-89
• 4.4.1 酯解酶分別刪除對菌體的影響82-84
• 4.4.2 酯解酶連續(xù)刪除對脂肪醇生產的影響84-85
• 4.4.3 酯解酶刪除對工程菌株代謝流的影響85-87
• 4.4.4 副產物代謝路徑基因的刪除對脂肪醇生產的影響87-88
• 4.4.5 脂肪醇生產的補料發(fā)酵88-89
• 4.5 小結89-91
• 5 核糖體結合序列改造強化脂肪醇合成91-103
• 5.1 引言91
• 5.2 材料和方法91-93
• 5.2.1 主要試劑與儀器91
• 5.2.2 引物,菌株和質粒91-93
• 5.2.3 培養(yǎng)基93
• 5.3 試驗方法93-95
• 5.3.1 RBS的計算93
• 5.3.2 RBS的整合93-95
• 5.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵條件95
• 5.3.4 脂肪醇產量的檢測95
• 5.4 結果與討論95-101
• 5.4.1 fabH RBS區(qū)的改造菌株的構建95
• 5.4.2 fabH RBS區(qū)的改造對脂肪醇產量的影響95-97
• 5.4.3 fabZ RBS區(qū)的改造菌株的構建97
• 5.4.4 fabZ RBS區(qū)的改造對脂肪醇產量的影響97-98
• 5.4.5 fabH fabZ RBS區(qū)同時改造菌株的構建98-99
• 5.4.6 fabH、fabZ RBS區(qū)同時改造對脂肪醇產量的影響99-100
• 5.4.7 菌株MGLHZS/pL1的補料發(fā)酵結果100-101
• 5.5 小結101-103
• 6 結論與展望103-107
• 6.1 主要結論103-104
• 6.2 創(chuàng)新之處104
• 6.3 今后的工作建議104-107
• 生化名詞縮寫表107-109
• 參考文獻109-119
• 附件119-131
• 個人簡歷及發(fā)表文章目錄131-133
• 致謝133

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