本文關(guān)鍵詞：桔青霉素單克隆抗體和單鏈抗體的篩選及鑒定研究

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【摘要】：桔青霉素(citrinin, CIT)是由青霉屬和曲霉屬等真菌產(chǎn)生的一種次級代謝產(chǎn)物,廣泛存在于多種農(nóng)產(chǎn)品和食品中。早年間,桔青霉素因為具有較好的抑菌效果,曾被作為抗生素進行使用,但后來經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)它也具有強烈的腎毒性和致癌性,嚴重危害人類和動物的健康。因此,建立一套針對桔青霉素殘留的檢測方法顯得非常必要,而制備抗桔青霉素的特異性抗體對于臨床檢測方法的建立則具有重要的現(xiàn)實意義。本研究利用化學(xué)偶聯(lián)方法分別制備了桔青霉素人工完全抗原CIT-BSA和CIT-OVA;采用細胞融合技術(shù)獲得了抗桔青霉素的雜交瘤細胞株3B11及其單克隆抗體；根據(jù)基因工程原理構(gòu)建了大容量、天然鼠源核糖體展示(Ribosome display, RD)單鏈抗體(Single-Chain Fragment Variant, scFv)文庫；運用核糖體展示技術(shù)篩選到了抗桔青霉素的單鏈抗體基因。研究成果為桔青霉素的殘留檢測奠定了基礎(chǔ)。1.桔青霉素完全抗原的合成與鑒定桔青霉素屬于小分子半抗原,不具有免疫原性,無法直接用來對機體進行免疫制備抗體,所以,必須首先通過與蛋白載體進行偶聯(lián)制成人工完全抗原。本研究采用碳二亞胺法,利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀亞胺(NHS)作為偶聯(lián)劑,牛血清白蛋白(BSA)和雞卵清白蛋白(OVA)作為蛋白載體,分別制備了CIT-BSA和CIT-OVA人工完全抗原,并使用紫外光譜分析、SDS-PAGE以及MALDI-TOF質(zhì)譜法分別對偶聯(lián)反應(yīng)前后物質(zhì)進行鑒定。鑒定結(jié)果顯示人工完全抗原CIT-BSA成功偶聯(lián),C1T與BSA的偶聯(lián)比例約為5：1,可以用來對動物機體進行免疫制備相應(yīng)的抗體。2.桔青霉素單克隆抗體的制備及鑒定為制備抗桔青霉素的單克隆抗體,本研究利用所制備的偶聯(lián)抗原CIT-BSA對Balb/C小鼠進行免疫,取免疫后的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0進行細胞融合,采用間接ELISA和競爭ELISA檢測方法進行篩選,經(jīng)3次亞克隆后篩選到5株穩(wěn)定分泌抗桔青霉素抗體的雜交瘤細胞株,分別為2A9、3B5、3B11、3C5、 6C1.所篩選到的單克隆抗體經(jīng)過初步鑒定,抗體亞類分別有IgM、IgG1、IgG2a;經(jīng)間接競爭ELISA檢測方法鑒定,單克隆抗體3B11對桔青霉素的IC50值為150.9 ng/mL,最低檢測限ICl0為5.42 ng/mL;與展青霉毒素(PAT)、黃曲霉毒素(AFB1)、伏馬毒素(FB1)和赭曲霉毒素(OTA)的交叉反應(yīng)率均低于0.01%；抗體親和力常數(shù)為7.75×107L/moL,屬于高親和力抗體。本實驗所制備的單抗具有較好的抑制效果、靈敏性和特異性,為快速檢測桔青霉素的酶聯(lián)免疫檢測方法的建立和檢測試劑盒的研制提供了技術(shù)依據(jù)。3.大容量天然鼠源核糖體展示單鏈抗體文庫的構(gòu)建與初步鑒定為構(gòu)建大容量天然鼠源核糖體展示(Ribosome display, RD)單鏈抗體(Single-Chain Fragment Variant, scFv)基因文庫,本研究通過提取SPF級小鼠脾臟總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,分別利用引物擴增鼠抗體的VH、VL和C1c基因,采用重疊延伸PCR (SOE-PCR)方法,通過Linker ((Gly4Ser)3)相互拼接,構(gòu)建了單鏈抗體scFv基因文庫和核糖體展示基因文庫：經(jīng)連接轉(zhuǎn)化,對所構(gòu)建基因文庫進行菌落PCR鑒定、序列測定和比對分析。所構(gòu)建核糖體展示基因文庫庫容量約為5.6×1013,基因片段全長大小約為1100 bp,基因文庫序列具有較好的完整性和多樣性。本試驗成功構(gòu)建了一個大容量天然鼠源核糖體展示單鏈抗體文庫,為進一步篩選單鏈抗體奠定了基礎(chǔ)。4.核糖體展示技術(shù)篩選抗桔青霉素的特異性單鏈抗體為獲得桔青霉素特異性單鏈抗體,本研究在所構(gòu)建的鼠源天然核糖體展示基因文庫的基礎(chǔ)上,采用核糖體展示技術(shù)進行體外轉(zhuǎn)錄和翻譯,分別以人工完全抗原CIT-BSA、CIT-OVA和蛋白載體BSA、OVA為包被抗原,采用間接ELISA方法對其進行篩選,親和篩選所獲得的mRNA運用真核原位RT-PCR方法進行回收,所獲得的cDNA利用表達載體pTIG-TRX在大腸桿菌內(nèi)進行可溶性表達,并利用間接ELISA方法對表達產(chǎn)物進行鑒定。經(jīng)過六輪親和篩選和間接ELISA方法鑒定,共獲得13個單鏈抗體基因,其中3個單鏈抗體(編號分別為23、68、109)與CIT具有較高的結(jié)合能力；間接競爭ELISA檢測結(jié)果顯示,68號單鏈抗體對CIT的IC5o值為1242.2 ng/mL,最低檢測限LOD:ICio為3.1 ng/mL;并且與展青霉毒素(PAT)、黃曲霉毒素(AFB1)、伏馬毒素(FB1)和赭曲霉毒素(OTA)的交叉反應(yīng)率均低于0.01%；本實驗運用核糖體展示技術(shù)獲得抗CIT的單鏈抗體,對于建立CIT的快速檢測方法具有重要的現(xiàn)實意義,同時也對與篩選其他小分子半抗原的特異性單鏈抗體以及建立新型檢測技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。綜上所述,本研究在人工完全抗原的基礎(chǔ)上制備了抗桔青霉素的單克隆抗體與單鏈抗體,為建立桔青霉素殘留檢測方法奠定了基礎(chǔ),同時也為其他小分子半抗原單鏈抗體的制備提供了技術(shù)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：桔青霉素 單克隆抗體 核糖體展示 單鏈抗體
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：TS207.3
【目錄】：

• 摘要10-13
• Abstract13-16
• 英文縮略詞表16-17
• 前言17-18
• 第一部分 文獻綜述18-32
• 第一章 桔青霉素及其檢測方法19-24
• 1 桔青霉素概述19-21
• 1.1 桔青霉素的理化性質(zhì)19-20
• 1.2 桔青霉素的毒性和抑菌性20-21
• 1.3 桔青霉素的限量標準21
• 2 桔青霉素的檢測方法21-23
• 2.1 薄層層析法22
• 2.2 高效液相色譜法22
• 2.3 酶聯(lián)免疫吸附測定法22-23
• 3 小結(jié)23-24
• 第二章 抗體制備研究進展24-32
• 1 抗體制備概述24-25
• 1.1 多克隆抗體的制備24
• 1.2 單克隆抗體的制備24-25
• 1.3 基因工程重組抗體的制備25
• 2 抗體庫技術(shù)25-31
• 2.1 噬菌體展示技術(shù)26-27
• 2.2 核糖體展示技術(shù)27-31
• 3 小結(jié)31-32
• 第二部分 研究內(nèi)容32-105
• 第三章 桔青霉素完全抗原的合成與鑒定33-43
• 摘要33-34
• 1 材料和方法34-37
• 1.1 材料34-35
• 1.1.1 主要試劑34
• 1.1.2 主要儀器34-35
• 1.2 方法35-37
• 1.2.1 桔青霉素人工完全抗原的合成35-36
• 1.2.2 桔青霉素人工完全抗原的紫外光譜分析鑒定36
• 1.2.3 桔青霉素人工完全抗原的SDS-PAGE鑒定36-37
• 1.2.4 桔青霉素人工完全抗原的MALDI-TOF鑒定以及偶聯(lián)比的測定37
• 2 結(jié)果37-39
• 2.1 桔青霉素及人工抗原的紫外光譜分析鑒定結(jié)果37-38
• 2.2 人工完全抗原的SDS-PAGE鑒定結(jié)果38-39
• 2.3 人工完全抗原的質(zhì)譜鑒定結(jié)果39
• 3 討論39-43
• 第四章 桔青霉素單克隆抗體的制備及鑒定43-75
• 摘要43-44
• 1 材料和方法44-57
• 1.1 材料44-45
• 1.1.1 主要試劑和耗材44
• 1.1.2 實驗動物44
• 1.1.3 細胞系44-45
• 1.1.4 主要儀器45
• 1.1.5 主要試劑的配制45
• 1.2 方法45-57
• 1.2.1 Bradford法測蛋白質(zhì)濃度45
• 1.2.2 動物免疫45-46
• 1.2.3 免疫小鼠血清效價測定46-48
• 1.2.4 單克隆抗體的制備與鑒定48-57
• 2 結(jié)果57-71
• 2.1 蛋白濃度的測定57-58
• 2.2 免疫小鼠血清效價的測定58-59
• 2.3 間接ELISA檢測方法的建立59-62
• 2.4 間接競爭ELISA檢測多抗血清的抑制性62
• 2.5 單克隆抗體細胞株的篩選與建立62-71
• 3 討論71-75
• 第五章 大容量天然鼠源核糖體展示單鏈抗體文庫的構(gòu)建與初步鑒定75-86
• 摘要75-76
• 1 材料和方法76-79
• 1.1 材料76
• 1.1.1 主要試劑76
• 1.1.2 主要儀器76
• 1.2 方法76-79
• 1.2.1 小鼠脾臟總RNA的提取76-77
• 1.2.2 cDNA的合成77
• 1.2.3 VH、Linker、VL和Cκ基因的擴增77
• 1.2.4 單鏈抗體scFv基因文庫的組裝和序列多樣性分析77-79
• 1.2.5 核糖體展示基因文庫的組裝和序列分析79
• 2 結(jié)果79-83
• 2.1 VH、Linker、VL和Cκ基因的擴增與鑒定79-82
• 2.2 單鏈抗體scFv基因文庫的擴增和序列多樣性分析鑒定82
• 2.3 核糖體展示基因文庫的擴增和序列分析鑒定82-83
• 3 討論83-86
• 第六章 核糖體展示技術(shù)篩選抗桔青霉素的特異性單鏈抗體86-105
• 摘要86-87
• 1 材料和方法87-96
• 1.1 材料87-88
• 1.1.1 主要試劑87-88
• 1.1.2 主要儀器88
• 1.1.3 主要試劑的配制88
• 1.2 方法88-96
• 1.2.1 核糖體展示基因文庫的體外轉(zhuǎn)錄翻譯88-89
• 1.2.2 固相親和篩選89-90
• 1.2.3 原位反轉(zhuǎn)錄回收90-91
• 1.2.4 PCR擴增及新一輪展示模板的構(gòu)建91
• 1.2.5 篩選后單鏈抗體基因克隆的篩選91
• 1.2.6 單鏈抗體基因的原核表達與鑒定91-94
• 1.2.7 抗桔青霉素單鏈抗體的篩選與鑒定94-95
• 1.2.8 抗桔青霉素單鏈抗體基因序列比對分析95-96
• 2 結(jié)果96-101
• 2.1 體外轉(zhuǎn)錄翻譯與親和篩選96-97
• 2.2 單鏈抗體基因克隆的篩選97
• 2.3 單鏈抗體基因的原核表達與Western blot鑒定97-98
• 2.4 抗桔青霉素單鏈抗體結(jié)合活性的鑒定98-99
• 2.5 抗桔青霉素單鏈抗體競爭抑制效果與特異性的鑒定99-101
• 2.6 抗桔青霉素單鏈抗體基因序列的比對分析101
• 3 討論101-105
• 結(jié)論105-106
• 創(chuàng)新點106-107
• 展望107-108
• 附錄Ⅰ 溶液配制108-113
• 參考文獻113-122
• 攻讀博士學(xué)位期間的主要成果122-123
• 致謝123

【參考文獻】

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本文編號：560043