本文關鍵詞：利用半理性和理性策略對酶活性及手性選擇性的設計

  更多相關文章： 手性化合物 理性設計 分子模擬 手性選擇性 酯酶BioH 酯酶RspE D-扁桃酸消旋酶

【摘要】：由于對映異構體之間理化性質和生理活性存在差異,手性化合物單體的光學純度是生物醫(yī)藥、精細化工和材料科學等諸多行業(yè)的重要標準之一。以酶介導的手性化合物的合成法,具有立體選擇性性高、反應條件溫和等優(yōu)點,是相關領域的研究熱點。而酶的活性和手性選擇性作為這種方法的關鍵因素,決定了該方法的效率和產(chǎn)品的光學純度。因此,有必要對酶的活性和手性選擇性進行優(yōu)化,以拓展其在手性化合物合成中的應用。酶工程可以從分子水平上調控酶與底物的相互作用,是一種行之有效的優(yōu)化酶催化性質的方法。本研究通過半理性和理性的酶工程策略,以在手性化合物合成中應用廣泛的酯酶和脫氫酶為研究對象,對它們的活性和手性選擇性進行設計優(yōu)化。首先,在前期對酯酶RspE在扁桃酸甲酯拆分中的手性選擇性的定向進化中,發(fā)現(xiàn)手性選擇性最優(yōu)的第四輪突變體CVH (E 30.8,比活力24 μmolmi-1mg-1)的活性大大低于第二輪突變體YH (E 8.7,比活力142 μmolmin-1mg-1),出現(xiàn)了活性與手性選擇性負相關變化的現(xiàn)象。本研究針對這一現(xiàn)象,采用結構分析與定點飽和突變相結合的半理性策略,經(jīng)過篩選得到了活性與手性選擇性同時保持高水平的突變體HMVY (E 36.8,比活力113 umolmin-1mg-1),其手性選擇性高于CVH并且活性與YH相當,實現(xiàn)了上述負相關現(xiàn)象的平衡。反應動力學分析表明,這種活性和手性選擇性負相關現(xiàn)象的產(chǎn)生和被平衡是由于提高手性選擇性所采取的途徑不同造成的。突變體CVH通過大幅度抑制非偏好型底物的催化效率提高手性選擇性,因而降低了拆分反應的活力；而突變體HMVY則通過特異性提高偏好型底物的催化效率,在提高手性選擇性的同時保持了拆分反應的速率。分子模擬結果驗證了反應動力學分析的結果。同時,對突變點氨基酸的分析表明,HMVY中的組氨酸增強了對偏好型底物催化基團的穩(wěn)定作用,同時纈氨酸和酪氨酸的協(xié)同配合改變了偏好型底物的結合位置和方式,優(yōu)化了其結合構象。其后,利用理性設計策略,對酯酶BioH在潛手性3-苯基戊二酸二甲酯的不對稱水解中的手性選擇性進行設計。蛋白-底物復合物的結構分析表明,底物中的三位取代基在蛋白活性位點中的朝向是決定蛋白手性選擇性的關鍵因素�；谶@一假設,利用定點突變在蛋白活性口袋中引入與潛在S型底物的苯環(huán)產(chǎn)生特異性π-π堆疊作用的芳香族氨基酸,得到了手性選擇性顯著提高的突變體L86F,產(chǎn)物S-3-苯基戊二酸單酯的光學純度由25%(WT)提高到了93%(L86F)。為了進一步證明以上理性設計策略的有效性和普適性,以酯酶RspE為研究對象,運用同樣的思路,對其在潛手性3-苯基戊二酸二甲酯的不對稱水解中的手性選擇性進行設計。通過引入芳香氨基酸殘基,使產(chǎn)物3-苯基戊二酸單酯的光學純度由野生型的13%(S)提高到突變體Y27R的99%(S),同時在不同位點引入該作用還得到了手性選擇性反轉的突變體M121F(50%,R)。這一結果不僅證明了該策略的有效性,可以分別得到S和R型的手性選擇性；同時還驗證了上述理性設計策略的普適性,可以適用于活性口袋不用的蛋白。此外,本研究還通過理性設計,對D-扁桃酸脫氫酶在R-鄰氯扁桃酸的氧化中的活性進行優(yōu)化。將關鍵位點的丙氨酸替換為組氨酸,嘗試在蛋白和鹵代底物之間引入鹵鍵作用,以穩(wěn)定蛋白底物復合物。最終得到的突變體A89H對R-鄰氯扁桃酸的活性是野生型的5倍。本研究通過半理性和理性的酶工程策略,實現(xiàn)了對酯酶BioH、酯酶RspE和D-扁桃酸脫氫酶的活性與手性選擇性的設計,有助于其在手性化合物的合成中的應用。
【關鍵詞】：手性化合物 理性設計 分子模擬 手性選擇性 酯酶BioH 酯酶RspE D-扁桃酸消旋酶
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：O629.8
【目錄】：

• 致謝5-6
• 摘要6-8
• Abstract8-15
• 1 緒論15-38
• 1.1 手性化合物及其合成15-19
• 1.1.1 手性化合物15-16
• 1.1.2 手性化合物的應用16-17
• 1.1.3 手性化合物的合成17-19
• 1.2 酶的手性選擇性及其改造19-28
• 1.2.1 酶的手性選擇性19-22
• 1.2.2 酶工程22-28
• 1.2.3 手性選擇性的改造28
• 1.3 分子模擬28-31
• 1.3.1 分子模擬簡介28-29
• 1.3.2 常用的分子模擬方法29-31
• 1.4 酯酶和脫氫酶及其在手性化合物合成中的應用31-36
• 1.4.1 酯酶31-34
• 1.4.2 脫氫酶34-36
• 1.5 本文研究的主要內容36-38
• 2 利用半理性設計平衡酯酶RspE定向進化中的活性與手性選擇性的負相關變化38-53
• 2.1 實驗材料38-40
• 2.1.1 菌株與質粒38-39
• 2.1.2 工具酶39
• 2.1.3 試劑39
• 2.1.4 主要儀器39-40
• 2.2 實驗方法40-45
• 2.2.1 分子對接及結構分析40-41
• 2.2.2 突變體庫的構建41-43
• 2.2.3 突變體庫的篩選43-44
• 2.2.4 優(yōu)勢突變體的活性測定44-45
• 2.2.5 代表突變體的動力學常數(shù)測定45
• 2.3 結果與討論45-52
• 2.3.1 結構分析及突變點選定45-47
• 2.3.2 突變體庫的篩選47-49
• 2.3.3 代表突變體動力學常數(shù)的測定49-50
• 2.3.4 活性選擇性負相關現(xiàn)象產(chǎn)生與被平衡的酶反應動力學原因50-51
• 2.3.5 活性選擇性負相關現(xiàn)象產(chǎn)生與被平衡的蛋白工程方法學原因51-52
• 2.4 小結52-53
• 3 酯酶RspE活性手性選擇性負相關變化現(xiàn)象的分子模擬53-67
• 3.1 實驗方法53-56
• 3.1.1 蛋白分子結構及突變體構建53
• 3.1.2 底物分子結構及力場參數(shù)確定53
• 3.1.3 蛋白-底物復合物的構建53-54
• 3.1.4 分子動力學模擬54-55
• 3.1.5 模擬結果分析55-56
• 3.2 結果與討論56-66
• 3.2.1 模擬體系平衡情況分析56-57
• 3.2.2 反應過渡態(tài)有效性分析57-60
• 3.2.3 功能基組原子的勢能分析60-61
• 3.2.4 口袋基組氨基酸與底物的相互作用能分析61-62
• 3.2.5 蛋白-小分子復合物的構象分析62-63
• 3.2.6 突變熱點氨基酸對蛋白-底物相互作用的貢獻分析63-65
• 3.2.7 活性與手性選擇性負相關變化現(xiàn)象產(chǎn)生與被平衡的分子機理65-66
• 3.3 本章小結66-67
• 4 酯酶BioH在對稱二酯的不對稱水解中的手性選擇性的設計67-81
• 4.1 實驗材料68
• 4.1.1 菌株與質粒68
• 4.1.2 酶和試劑68
• 4.1.3 主要儀器68
• 4.2 實驗方法68-73
• 4.2.1 3-苯基戊二酸二甲酯的合成68-69
• 4.2.2 BioH的克隆及突變體的構建69-70
• 4.2.3 蛋白表達與純化70
• 4.2.4 蛋白純度表征及濃度測定70
• 4.2.5 3-苯基戊二酸二甲酯的不對稱水解70-71
• 4.2.6 酯酶BioH對3-苯基戊二酸二甲酯的不對稱水解及產(chǎn)物表征71
• 4.2.7 分子動力學模擬71-73
• 4.3 結果與討論73-80
• 4.3.1 酯酶BioH野生型對3-苯基戊二酸二甲酯的不對稱水解73-74
• 4.3.2 野生型BioH與底物的結合分析74-76
• 4.3.3 突變體設計76
• 4.3.4 酯酶BioH突變體對3-苯基戊二酸二甲酯的不對稱水解76-78
• 4.3.5 蛋白-底物復合物的分子模擬78-80
• 4.4 本章小結80-81
• 5 酯酶RspE在對稱二酯的不對稱水解中的手性選擇性的設計81-93
• 5.1 實驗材料與方法81-82
• 5.2 結果與討論82-92
• 5.2.1 酯酶RspE野生型對3-苯基戊二酸二甲酯的不對稱水解82-83
• 5.2.2 酯酶RspE野生型與底物的結合分析83-85
• 5.2.3 突變體設計85
• 5.2.4 酯酶RspE突變體對3-苯基戊二酸二甲酯的不對稱水解85-87
• 5.2.5 蛋白-底物復合物的分子模擬87-89
• 5.2.6 酯酶在對稱二酯不對稱水解反應中手性選擇性的來源89-90
• 5.2.7 手性選擇性設計策略討論90-92
• 5.3 本章小結92-93
• 6 D-扁桃酸脫氫酶DMdh對鄰氯扁桃酸的活性的設計93-109
• 6.1 實驗材料94
• 6.1.1 菌株與質粒94
• 6.1.2 酶和試劑94
• 6.1.3 主要儀器94
• 6.2 實驗方法94-98
• 6.2.1 D-扁桃酸脫氫酶DMdh基因的亞克隆94
• 6.2.2 突變體A89H的構建94-95
• 6.2.3 蛋白的表達純化95
• 6.2.4 蛋白純度表征及濃度測定95
• 6.2.5 扁桃酸及鄰氯扁桃酸的脫氫氧化95-96
• 6.2.6 分子動力學模擬96-98
• 6.3 結果與討論98-108
• 6.3.1 DMdh野生型對扁桃酸及鄰氯扁桃酸的脫氫氧化98-100
• 6.3.2 底物分子結構分析100-102
• 6.3.3 DMdh野生型的結構及分子動力學模擬102-105
• 6.3.4 突變體設計及活力測定105-106
• 6.3.5 突變體的分子動力學模擬106-108
• 6.4 本章小結108-109
• 7 結論與展望109-111
• 參考文獻111-122
• 附錄 用于基因合成的DMdh序列122-123
• 作者簡歷123-124

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本文編號：529382