本文關(guān)鍵詞：基于均一PLA微球的新型乙肝疫苗佐劑設(shè)計(jì)制備及其免疫增強(qiáng)效果研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：乙型肝炎是乙肝病毒(HBV)感染引起的傳染性疾病,感染的慢性化往往導(dǎo)致肝硬化和肝癌,嚴(yán)重威脅人類的健康。目前尚沒有治愈乙肝的有效藥物,接種疫苗仍然是預(yù)防HBV感染的有效方法。基因重組的乙肝疫苗的安全性得到改善,但其免疫原性和穩(wěn)定性降低,需要添加佐劑才能誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答。鋁鹽佐劑是目前人用疫苗的主要佐劑,雖然其能夠增強(qiáng)抗原誘導(dǎo)的抗體反應(yīng),但提升疫苗的細(xì)胞免疫應(yīng)答能力有限,而細(xì)胞免疫是機(jī)體發(fā)揮抗HBV等胞內(nèi)感染病毒的關(guān)鍵,因此新一代的乙肝疫苗及治療性乙肝疫苗亟需開發(fā)能夠提升細(xì)胞免疫的新型佐劑系統(tǒng)。納微球顆粒佐劑因其大小和易于激活免疫系統(tǒng)的各類病原體的直徑類似,具有良好的研究與應(yīng)用前景。其中,可降解聚合物-聚乳酸(PLA)類納微球是最有前景的顆粒佐劑之一,納微球能夠促進(jìn)抗原被提呈細(xì)胞攝取并經(jīng)MHCI途徑提呈,誘導(dǎo)更高水平的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。傳統(tǒng)微球佐劑疫苗研究一般采用包埋的方式攜載抗原,由于包埋的過程往往涉及油水界面、超聲、機(jī)械攪拌等劇烈條件,易造成抗原的失活變性；這些方法所制備的納微球粒徑不均一,分布范圍寬,最終影響體內(nèi)藥效發(fā)揮；另外影響包埋效率和抗原活性的因素眾多,都極大地限制了其放大生產(chǎn)。新型佐劑的設(shè)計(jì)需要兼顧易于生產(chǎn)制備和良好的免疫效果。本論文圍繞PLA微球在新型乙肝疫苗中的可應(yīng)用性展開,在前期研究的基礎(chǔ)上,采用實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的新型膜乳化技術(shù)制備粒徑均一的納微球顆粒,采用微球表面吸附的溫和方式攜載抗原。第二章證實(shí)抗原和均一的PLA微球復(fù)配混合能夠誘導(dǎo)和鋁佐劑相當(dāng)?shù)腎gG抗體水平,同時(shí)增強(qiáng)相關(guān)細(xì)胞因子分泌和T細(xì)胞應(yīng)答。分析發(fā)現(xiàn),PLA微球本身對抗原的吸附率小于5%,為了提升微球的抗原吸附量,第三章設(shè)計(jì)制備了PLA微球表面磷酸鈣修飾的CaP-PLA微球,其抗原吸附率提升至50%以上。免疫結(jié)果證實(shí),CaP-PLA微球吸附抗原能促進(jìn)DC活化,進(jìn)一步增強(qiáng)微球在體內(nèi)誘導(dǎo)的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。CaP-PLA微球呈電中性,吸附抗原后呈負(fù)電性,影響抗原吸附,也不利于微球和抗原提呈細(xì)胞的相互作用。為了系統(tǒng)考察微球抗原吸附、電荷和免疫效果的關(guān)系,在第四章中,設(shè)計(jì)采用三種多聚陽離子聚合物殼聚糖(CS)、殼聚糖鹽酸鹽(CSC)和聚乙烯亞胺(PEI)對PLA微球表面進(jìn)行鍍層修飾,制備了表面具有不同正電荷的陽離子PLA微球。隨著微球正電荷的遞增,抗原吸附量隨隨之顯著增加。隨著微球電荷和抗原吸附量的增加,巨噬細(xì)胞的活化和抗原攝取-提呈隨之增強(qiáng)。免疫小鼠后抗體和細(xì)胞免疫相關(guān)的細(xì)胞因子分泌也隨微球抗原吸附量的增加而顯著增強(qiáng),其中Thl細(xì)胞免疫相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ和IL-12的水平尤其顯著。表明通過陽離子修飾增加PLA微球表面的正電荷,增強(qiáng)PLA微球的抗原吸附能夠顯著增強(qiáng)微球疫苗的免疫應(yīng)答,尤其是細(xì)胞免疫。為了優(yōu)選適合陽離子改性PLA微球的免疫途徑,在第五章中,考察了皮下、肌肉和腹腔注射對疫苗免疫應(yīng)答的種類和強(qiáng)度的影響,證實(shí)肌肉注射是適合PLA微球的有效接種途徑,它能夠誘導(dǎo)比鋁佐劑疫苗更高的保護(hù)性免疫應(yīng)答,尤其是細(xì)胞免疫。綜合上述影響PLA微球佐劑效果的因素,第六章采用一步法設(shè)計(jì)制備了安全性更高的陽離子脂-PLA復(fù)合的DDAB-PLA微球：DDAB-PLA微球電荷在+30mV左右,抗原吸附率大于75%。肌肉免疫證實(shí),DDAB-PLA微球吸附抗原能夠誘導(dǎo)比鋁佐劑更高水平的IgG抗體(1.3倍)和顯著增強(qiáng)的細(xì)胞免疫相關(guān)細(xì)胞因子分泌以及效應(yīng)性T細(xì)胞應(yīng)答,顯示出更出色的佐劑效果。DDAB-PLA微球易于制備和放大,免疫效果良好,有望用于開發(fā)新型乙肝疫苗和治療性乙肝疫苗。
【關(guān)鍵詞】：PLA 微球 佐劑 乙肝表面抗原 吸附 細(xì)胞免疫
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院研究生院(過程工程研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：TQ460.6
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-15
• 1 文獻(xiàn)綜述15-49
• 1.1 免疫系統(tǒng)與免疫應(yīng)答概述15-22
• 1.1.1 免疫系統(tǒng)組成15
• 1.1.2 抗原15-16
• 1.1.3 佐劑16
• 1.1.4 抗原提呈16-17
• 1.1.5 免疫預(yù)防17-18
• 1.1.6 免疫應(yīng)答18-22
• 1.1.6.1 固有免疫18-20
• 1.1.6.2 固有免疫特點(diǎn)20-21
• 1.1.6.3 適應(yīng)性免疫應(yīng)答21-22
• 1.1.6.4 適應(yīng)性免疫應(yīng)答的特點(diǎn)22
• 1.2 乙肝病毒與乙肝疫苗22-27
• 1.2.1 HBV22-24
• 1.2.2 HBV與免疫應(yīng)答24-26
• 1.2.2.1 HBV和固有免疫24-25
• 1.2.2.3 HBV和適應(yīng)性免疫應(yīng)答25-26
• 1.2.3 慢性乙肝與免疫耐受26-27
• 1.3 乙肝疫苗與乙肝表面抗原27-32
• 1.3.1 乙肝表面抗原27-29
• 1.3.2 乙肝疫苗的發(fā)展29-30
• 1.3.3 乙肝疫苗存在的問題30
• 1.3.4 治療性乙肝疫苗30-32
• 1.4 聚合物納微球疫苗佐劑32-37
• 1.4.1 聚合物納微球的制備33-36
• 1.4.1.1 溶劑揮發(fā)法33-34
• 1.4.1.2 化學(xué)交聯(lián)法34-35
• 1.4.1.3 自組裝法35-36
• 1.4.2 快速膜乳化技術(shù)36-37
• 1.5 納微球疫苗佐劑研究進(jìn)展37-40
• 1.5.1 微包埋抗原微球疫苗37-39
• 1.5.2 表面吸附抗原微球疫苗39-40
• 1.6 納微球佐劑的優(yōu)勢40-45
• 1.6.1 納微球佐劑的抗原APC靶向40-41
• 1.6.2 納微球佐劑增強(qiáng)抗原交叉提呈41-44
• 1.6.3 納微球載體的免疫激活作用44-45
• 1.7 聚合物納微球用于疫苗佐劑的優(yōu)勢和挑戰(zhàn)45-46
• 1.8 立題依據(jù)和研究目標(biāo)46-49
• 1.8.1 立題依據(jù)46-47
• 1.8.2 研究目標(biāo)及方法47-49
• 2 均一PLA微球用于乙肝疫苗的可行性考察49-65
• 2.1 引言49-50
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料和方法50-58
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑50-51
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備和儀器51-52
• 2.2.3 試驗(yàn)方法52-58
• 2.2.3.1 PLA微球制備52
• 2.2.3.2 微球表征52-53
• 2.2.3.3 佐劑-抗原劑型配伍53
• 2.2.3.4 小鼠及免疫方案53-54
• 2.2.3.5 免疫結(jié)果測定54-57
• 2.2.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析57-58
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論58-64
• 2.3.1 PLA微球制備和表征58-59
• 2.3.2 體液免疫應(yīng)答59-62
• 2.3.3 細(xì)胞因子測定62-63
• 2.3.4 ELISPOT分析63-64
• 2.4 本章小結(jié)64-65
• 3 CaP-PLA微球制備及其佐劑效果考察65-93
• 3.1 引言65-66
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料和方法66-77
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑66-67
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備和儀器67-68
• 3.2.3 試驗(yàn)方法68-77
• 3.2.3.1 CaP-PLA微球制備68-69
• 3.2.3.2 PLA微球制備69-70
• 3.2.3.3 微球表征70
• 3.2.3.4 HBsAg吸附70-71
• 3.2.3.5 CaP-PLA微球表面酸敏特性考察71
• 3.2.3.6 小鼠髓源DC(BMDC)提取及體外活化考察71-72
• 3.2.3.7 小鼠及免疫方案72-74
• 3.2.3.8 免疫結(jié)果測定74-77
• 3.2.3.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析77
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論77-92
• 3.3.1 PLA和CaP-PLA微球制備與表征77-79
• 3.3.2 CaP-PLA微球的酸敏特性79-82
• 3.3.3 體外DC活化82-83
• 3.3.4 血清中IgG,IgG1,IgG2a及IgM效價(jià)83-87
• 3.3.5 脾細(xì)胞體外增殖87-89
• 3.3.6 細(xì)胞因子測定89-92
• 3.4 本章小結(jié)92-93
• 4 陽離子修飾PLA微球制備及其對PLA佐劑性能的調(diào)節(jié)93-121
• 4.1 引言93-94
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料和方法94-105
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑94-95
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備和儀器95-96
• 4.2.3 試驗(yàn)方法96-105
• 4.2.3.1 PLA微球制備96
• 4.2.3.2 PLA微球的鍍層修飾96-97
• 4.2.3.3 微球表征97
• 4.2.3.4 HBsAg吸附97-98
• 4.2.3.5 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離及培養(yǎng)98-99
• 4.2.3.6 CCK-8法測定微球的細(xì)胞毒性99-100
• 4.2.3.7 巨噬細(xì)胞抗原攝取分析100-101
• 4.2.3.8 小鼠及免疫方案101-102
• 4.2.3.9 免疫結(jié)果測定102-105
• 4.2.3.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析105
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論105-120
• 4.3.1 微球制備和表征105-107
• 4.3.2 微球吸附乙肝表面抗原107-108
• 4.3.3 體外抗原攝取108-110
• 4.3.4 抗原胞內(nèi)定位110-111
• 4.3.5 微球的細(xì)胞毒性111-112
• 4.3.6 巨噬細(xì)胞活化112-114
• 4.3.7 IgM和IgG抗體效價(jià)114-116
• 4.3.8 細(xì)胞因子測定116-118
• 4.3.9 ELISPOT分析118-120
• 4.4 本章小結(jié)120-121
• 5 免疫途徑對微球佐劑疫苗的應(yīng)答調(diào)節(jié)121-145
• 5.1 引言121-122
• 5.2 實(shí)驗(yàn)材料和方法122-132
• 5.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑122-123
• 5.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備和儀器123-124
• 5.2.3 試驗(yàn)方法124-132
• 5.2.3.1 CSC-PLA微球制備124
• 5.2.3.2 PLA微球的鍍層修飾124-125
• 5.2.3.3 微球表征125
• 5.2.3.4 HBsAg吸附125-126
• 5.2.3.5 小鼠髓源DC(BMDC)提取及體外活化考察126-127
• 5.2.3.6 小鼠及免疫方案127-129
• 5.2.3.7 免疫結(jié)果測定129-132
• 5.2.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析132
• 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論132-142
• 5.3.1 CSC-PLA微球制備與表征132-133
• 5.3.2 體外佐劑效果評價(jià)133-134
• 5.3.3 體液免疫應(yīng)答分析134-137
• 5.3.4 脾細(xì)胞活化137-139
• 5.3.5 細(xì)胞因子測定139-142
• 5.4 本章小結(jié)142-145
• 6 DDAB-PLA微球制備及其佐劑效果考察145-171
• 6.1 引言145-146
• 6.2 實(shí)驗(yàn)材料和方法146-157
• 6.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑146-147
• 6.2.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備和儀器147-148
• 6.2.3 試驗(yàn)方法148-157
• 6.2.3.1 DDAB-PLA微球制備148-149
• 6.2.3.2 PLA微球制備149
• 6.2.3.3 微球表征149-150
• 6.2.3.4 HBsAg吸附150
• 6.2.3.5 小鼠髓源DC(BMDC)提取及體外活化考察150-152
• 6.2.3.6 小鼠及免疫方案152-153
• 6.2.3.7 免疫結(jié)果測定153-157
• 6.2.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析157
• 6.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論157-169
• 6.3.1 DDAB-PLA微球制備和表征157-160
• 6.3.2 微球的細(xì)胞毒性160
• 6.3.3 體外DC活化160-162
• 6.3.4 血清中IgM,IgG,IgG1及IgG2a效價(jià)162-164
• 6.3.5 脾細(xì)胞增殖164-165
• 6.3.6 細(xì)胞因子測定165-169
• 6.3.7 CTL活化169
• 6.4 本章小結(jié)169-171
• 7 結(jié)論與展望171-177
• 7.1 引言171-172
• 7.2 本論文的主要結(jié)論172-173
• 7.3 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)173-175
• 7.4 工作展望175-177
• 7.4.1 DDAB-PLA微球佐劑乙肝疫苗劑型優(yōu)化175
• 7.4.2 DDAB-PLA微球在其他抗原疫苗中的應(yīng)用及其免疫增強(qiáng)機(jī)制175
• 7.4.3 DDAB-PLA微球中DDAB含量對微球免疫效果的調(diào)節(jié)175-176
• 7.4.4 聯(lián)合TLR受體等免疫增強(qiáng)劑共用176
• 7.4.5 DDAB-PLA微球的系統(tǒng)毒性和代謝176-177
• 符號表177-179
• 參考文獻(xiàn)179-191
• 個(gè)人簡歷及發(fā)表文章目錄191-195
• 致謝195

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  本文關(guān)鍵詞：基于均一PLA微球的新型乙肝疫苗佐劑設(shè)計(jì)制備及其免疫增強(qiáng)效果研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：503696