發(fā)布時間：2017-05-30 10:10

  本文關鍵詞：農產品中黃曲霉毒素新型免疫分析技術研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：黃曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)是主要由黃曲霉和寄生曲霉產生,自然分布極為廣泛的一類毒性超強的化合物,也是目前公認的最強的致癌物質,世界衛(wèi)生組織(WHO)的癌癥研究機構(IARC)于1993年將黃曲霉毒素劃分為Ⅰ類致癌物。受黃曲霉毒素污染的農產品嚴重威脅消費者身體健康與生命安全。因此,開發(fā)針對這類致癌物的檢測技術,為農產品和食品安全提供技術保障就變得十分重要。近幾十年來,多種黃曲霉毒素的檢測技術被開發(fā)出來,其中有HPLC,LC-MS/MS,以及免疫分析法等等。在這些方法中,免疫分析方法因為具有靈敏度高,特異性強,檢測成本低廉等優(yōu)點而成為檢測領域的一個新興熱點研究方向。近些年來,本實驗室先后成功開發(fā)了黃曲霉毒素熒光增強免疫親和檢測技術、黃曲霉毒素納米金免疫層析檢測技術和黃曲霉毒素銪時間分辨熒光免疫層析檢測技術,并在農產品和食品等檢測領域得到了廣泛應用。隨著技術的革新與進步,一些新的免疫分析技術也被不斷開發(fā)出來。比如非標記免疫分析技術,只需要一步反應就可以完成檢測,是一種直接、省時的檢測方法;又比如免疫PCR技術,它是一種新型的免疫檢測技術,能將ELISA的諸多優(yōu)點與PCR擴增技術相結合,有著更高的靈敏度與更寬的線性范圍;還有環(huán)介導的等溫擴增技術,它是最近幾年才被開發(fā)出來的新型的核酸擴增技術,比傳統(tǒng)的PCR更靈敏,擴增效率更高,并且不需要特殊的儀器設備。本研究以實驗室已經研制的抗黃曲霉單克隆抗體1C11以及抗獨特型納米抗體噬菌體V2-5為基礎,建立了三種新型的免疫分析方法,為農產品中黃曲霉毒素的檢測帶來了新的思路與技術平臺。本研究的主要內容與創(chuàng)新點如下:1.首次發(fā)現(xiàn)了黃曲霉毒素熒光免疫淬滅現(xiàn)象,并據(jù)此研究建立了基于抗體誘導熒光淬滅效應的黃曲霉毒素非標記免疫分析技術,該方法快捷,簡單,成本低廉,只需要一步反應便可完成檢測,有著十分廣闊的應用前景。基于特異性免疫結合反應誘導的熒光淬滅效應,我們建立了一種簡單,直接,非標記的免疫分析方法。作為模型分析物的AFB1,其內熒光能夠被特異性的抗AFB1單克隆抗體淬滅,這種熒光淬滅效應被用來定量檢測AFB1。AFB1的熒光值先被2,6-二甲基-β-環(huán)糊精增強,然后抗AFB1抗體1C11被加入到混合物里面,進行免疫反應。熒光掃描結果表明,在10%的甲醇水溶液中,與1C11反應完畢后,AFB1的熒光值明顯地下降了。在最優(yōu)參數(shù)的基礎上,這種直接非標記的免疫分析技術被用來定量檢測AFB1。我們建立了淬滅標準曲線,標準曲線有著很好的線性與相關性,R2=0.9998,線性范圍為1-20 ng/m L,檢測限為0.35ng/m L。本方法與HPLC進行了對比,結果表明本方法的回收率與HPLC的回收率相符,說明本方法能夠應用于花生樣品中AFB1的檢測。綜上,這種基于熒光淬滅效應的非標記免疫分析技術,可以被廣泛應用于AFB1及其他有內熒光的物質的免疫檢測。與傳統(tǒng)的免疫分析方法相比,本方法十分簡便并且省時;另外,本方法由于不需要劇毒的抗原,因此對環(huán)境十分友好,可以減少對操作人員健康的影響,并且節(jié)省檢測成本。2.首次建立了基于熒光定量PCR的黃曲霉毒素免疫分析技術,并應用于花生、大米、玉米、飼料樣品的實際檢測,將原方法的靈敏度提升了4倍,給黃曲霉毒素的檢測帶來新的思路和發(fā)展方向。本研究利用抗黃曲霉毒素獨特型納米抗體噬菌體,設計了針對其編碼納米抗體基因序列的特異性引物,建立了基于熒光定量PCR的黃曲霉毒素免疫分析技術。這種新型的免疫分析技術能夠把ELISA的諸多優(yōu)點與PCR擴增技術整合起來。本方法的檢測限為0.02 ng/m L,相比傳統(tǒng)的噬菌體ELISA而言,靈敏度提升了4倍,另外,本方法的線性范圍也更寬。本方法成功地應用到了花生、大米、玉米、飼料這四種黃曲霉毒素主要污染樣品的檢測中,添加回收率為77.05-122.16%。為了進一步驗證本方法,將檢測結果與HPLC方法進行了對比,在玉米和花生樣品中,兩種方法的相關性為0.991,說明兩種方法有著很好的一致性。本研究表明,抗獨特型納米抗體噬菌體可以用來建立針對小分子污染物的高靈度熒光定量PCR檢測技術,這也是熒光定量PCR方法首次應用于農產品中黃曲霉毒素的免疫檢測。另外,基于重組噬菌體的這種獨特的生物學特性,可以通過它建立農產品中多種真菌毒素的同步檢測技術。3.建立了以環(huán)介導等溫擴增技術為基礎的黃曲霉毒素免疫分析方法,并應用于花生樣品中黃曲霉毒素的檢測,該方法簡單、快捷、靈敏、經濟且不需要大型儀器輔助,為黃曲霉毒素的現(xiàn)場快速檢測提供了新的選擇方案。基于抗體1C11與納米抗體噬菌體V2-5,我們建立了基于環(huán)介導等溫擴增(LAMP)的黃曲霉毒素免疫檢測技術。LAMP反應在0.2 m L的PCR管中進行,反應體系由以下幾種成份組成:d NTPs,甜堿,Mg SO4,p H8.8 Tris-HCl,KCl,(NH4)2SO4,Tween-20,DNA模版,四種特異引物(B3,F3,FIP,BIP)以及Bst DNA聚合酶。反應流程是將PCR管置于63 oC的恒溫水浴鍋中40min,然后于95 oC恒溫2 min,使酶失活以終止反應。該方法用于檢測黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的檢測限分別為:0.1 ng/m L、0.1 ng/m L、0.2 ng/m L、1 ng/m L。免疫LAMP技術原理是將競爭的免疫反應與LAMP方法相結合,該方法的檢測結果可以直接用肉眼判定,當指示劑顏色為紫羅蘭時,為陽性結果,當指示劑為天藍色時,為陰性結果。以花生樣品為代表,將免疫LAMP方法與HPLC進行了對比,兩種方法的結果一致。綜上可知,免疫LAMP方法不需要大型儀器輔助,是一種簡單、快捷、靈敏且經濟的檢測方法,并可以應用于農產品中黃曲霉毒素的免疫檢測。
【關鍵詞】：黃曲霉毒素 非標記免疫分析 熒光淬滅 熒光定量PCR 環(huán)介導等溫擴增
【學位授予單位】：中國農業(yè)科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：TS207.3
【目錄】：

• 摘要5-7
• abstract7-18
• 英文縮略表18-20
• 第一章 引言20-41
• 1.1 農產品小分子污染物免疫檢測技術概述20-29
• 1.1.1 農產品小分子污染物概述20
• 1.1.2 小分子污染物免疫檢測技術20-29
• 1.2 黃曲霉毒素免疫檢測技術研究現(xiàn)狀29-36
• 1.2.1 黃曲霉毒素概述29-33
• 1.2.2 黃曲霉毒素免疫檢測技術研究現(xiàn)狀33-36
• 1.3 黃曲霉毒素免疫檢測技術發(fā)展趨勢36-41
• 1.3.1 綠色免疫分析方法36-37
• 1.3.2 非標記的免疫分析方法37
• 1.3.3 黃曲霉毒素納米抗體技術37-39
• 1.3.4 免疫分析方法與PCR方法的聯(lián)用39-40
• 1.3.5 免疫分析方法與環(huán)介導等溫擴增方法的聯(lián)用40-41
• 第二章黃曲霉毒素免疫熒光淬滅效應及分析方法研究41-65
• 2.1 引言41
• 2.2 材料41-45
• 2.2.1 儀器及耗材41-42
• 2.2.2 主要試劑42-43
• 2.2.3 雜交瘤細胞株及實驗動物43
• 2.2.4 主要緩沖液及培養(yǎng)基43-45
• 2.3 方法45-49
• 2.3.1 抗體制備及純化45-47
• 2.3.2 AFB1熒光及淬滅效應47-48
• 2.3.3 熒光增強劑的選擇48
• 2.3.4 基于熒光淬滅效應AFB1免疫分析方法的建立48-49
• 2.3.5 基于熒光淬滅效應AFB1免疫分析方法在樣品分析中的應用49
• 2.4 結果49-62
• 2.4.1 抗體純化效果鑒定49-51
• 2.4.2 AFB_1的自身熒光強度51-52
• 2.4.3 AFB_1的熒光淬滅效應52-53
• 2.4.4 三種熒光增強劑的熒光增強效果53-55
• 2.4.5 熒光增強劑的選擇55-56
• 2.4.6 基于熒光淬滅效應AFB1免疫分析方法的建立56-60
• 2.4.7 樣品添加回收測定60-61
• 2.4.8 與HPLC方法進行結果對比61-62
• 2.5 討論62-64
• 2.5.1 熒光增強劑的選擇62-63
• 2.5.2 抗體對黃曲霉毒素熒光淬滅機理63-64
• 2.5.3 基于熒光淬滅效應的黃曲霉毒素免疫分析方法應用前景64
• 2.6 小結64-65
• 第三章黃曲霉毒素實時熒光定量PCR免疫分析方法研究65-89
• 3.1 引言65-66
• 3.2 材料66-68
• 3.2.1 儀器及耗材66
• 3.2.2 主要試劑66-67
• 3.2.3 抗體和菌株67
• 3.2.4 主要緩沖液和培養(yǎng)基67-68
• 3.3 方法68-73
• 3.3.1 納米抗體噬菌體V2-5 的擴增68-70
• 3.3.2 熒光定量PCR參數(shù)優(yōu)化70-71
• 3.3.3 黃曲霉毒素實時熒光定量PCR免疫分析方法的建立71-72
• 3.3.4 黃曲霉毒素實時熒光定量PCR免疫分析方法在樣品檢測中的應用72-73
• 3.4 結果73-85
• 3.4.1 納米抗體噬菌體V2-5 的ELISA鑒定73
• 3.4.2 熒光定量PCR參數(shù)優(yōu)化73-77
• 3.4.3 黃曲霉毒素實時熒光定量PCR免疫分析方法的建立77-80
• 3.4.4 黃曲霉毒素實時熒光定量PCR免疫分析方法在樣品檢測中的應用80-85
• 3.5 討論85-88
• 3.5.1 抗獨特型納米抗體噬菌體的優(yōu)點85-87
• 3.5.2 黃曲霉毒素實時熒光定量PCR免疫分析方法靈敏度87
• 3.5.3 基質效應87
• 3.5.4 黃曲霉毒素實時熒光定量PCR免疫分析方法應用前景87-88
• 3.6 小結88-89
• 第四章黃曲霉毒素環(huán)介導等溫擴增免疫分析方法研究89-104
• 4.1 引言89
• 4.2 材料89-91
• 4.2.1 儀器及耗材89-90
• 4.2.2 主要試劑90
• 4.2.3 抗體和菌株90
• 4.2.4 主要緩沖液和培養(yǎng)基90-91
• 4.3 方法91-94
• 4.3.1 納米抗體噬菌體V2-5 的擴增91
• 4.3.2 引物的設計與選擇91-93
• 4.3.3 反應條件的優(yōu)化93
• 4.3.4 LAMP目視檢測方法93-94
• 4.3.5 黃曲霉毒素LAMP免疫分析方法的建立94
• 4.4 結果94-101
• 4.4.1 引物的篩選94-95
• 4.4.2 引物特異性測試95-96
• 4.4.3 反應條件的優(yōu)化96-98
• 4.4.4 LAMP目視檢測方法98-99
• 4.4.5 黃曲霉毒素LAMP免疫分析方法的建立99-101
• 4.5 討論101-103
• 4.5.1 LAMP引物設計101-102
• 4.5.2 LAMP目視檢測指示劑的選擇102
• 4.5.3 黃曲霉毒素LAMP免疫分析方法的靈敏度102-103
• 4.5.4 黃曲霉毒素LAMP免疫分析方法的應用前景103
• 4.6 小結103-104
• 第五章全文結論104-106
• 參考文獻106-116
• 致謝116-117
• 作者簡歷117

【參考文獻】

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  本文關鍵詞：農產品中黃曲霉毒素新型免疫分析技術研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：406926