光學活性的手性砌塊是許多藥物的關鍵中間體,生物催化是制備高光學純度手性藥物砌塊的重要方法。但是,許多生物催化過程由于酶表達量低、穩(wěn)定性差、難以重復使用或反應過程參數(shù)設置不合理等技術問題,導致生產效率低、成本高,難以實現(xiàn)產業(yè)化應用。本論文選取三個手性藥物砌塊的酶促合成反應作為典型案例,針對其關鍵技術瓶頸問題,分別采用基因異源表達、酶固定化及過程再優(yōu)化等不同策略,顯著提高了所用生物催化劑的比生產率,有力促進了相關生物催化過程的產業(yè)化應用,并為其他酶促反應的合成應用提供了成功案例。1.針對野生型微生物中酶表達水平不高導致粗酶制劑比生產率低下的問題,本文以西司他汀前體(S)-2,2-二甲基環(huán)丙烷甲酸酯的酶促合成為案例,通過對實驗室前期分離的野生型紅球菌ECU1013的酯酶基因進行克隆和異源表達,強化了酶的表達水平,極大地提高了酶制劑的催化效率。重組酶制劑的比生產率提高了13倍,酶促反應底物上載量由62.5 mM提高到500 mM,反應時間由120 h縮短為16 h。在十克級規(guī)模制備實驗中,產品分離收率30.2%(最大理論轉化率為50%),光學純度為97.4%ee。2.針對游離酶穩(wěn)定性差、難以重...

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【部分圖文】：

圖２．１基因文庫的Ｈ了酸甘油酷平板初篩??Ｆｉｇｕｒｅ?２．１?Ｉｎｉｔｉａｌ?ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?ｏｆ?ｇｅｎｅ?ｌｉｂｒａｒｙ?ｂｙ?ｇｌｙｃｅｒｙｌ?ｔｒｉｂｕｔｙｒａｔｅ．??

圖２．１基因文庫的Ｈ了酸甘油酷平板初篩??ｒｅ?２．１?Ｉｎｉｔｉａｌ?ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ?ｏｆ?ｇｅｎｅ?ｌｉｂｒａｒｙ?ｂｙ?ｇｌｙｃｅｒｙｌ?ｔｒｉｂｕ圈的菌落進行培養(yǎng)，菌體離也，用ＫＰＢＯＯＯｍＭＤｍｍ，°，

圖２．２重沮蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳圖??

?０．１７?３．０??純化的酶通過ＳＤＳ－ＰＡＧＥ進行分析，達到單一條帶的純度，見圖２．３，其分子量大約??為３５．０ｋＤａ。進而采用ＴＳＫＧ２０００ＳＷＸ１蛋白質層析柱對酶進行分子量分析，洗脫的蛋白??同樣呈現(xiàn)單一條帶，其表觀分子量為６９．８?ｋＤａ。結果表明ｉ？ＡＥｓｔｌ是一....

圖２．４?ｐＨ對ＷｆＥｓｔｒ活性的影響??Ｆｉｇｕｒｅ?２．４?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?ｐＨ?ｏｎ?ａｃｔｉｖｉｔｙ?ｏｆ?ｐｕｒｉｆｉｅｄ?／？ＡＥｓｔｌ．??

（Ａ：?ＰＥＴ２８ａ）?（Ｂ：?ｐＥＴ４３ａ）??圖２．２重沮蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電泳圖??Ｆｉｇｕｒｅ?３．２?Ｓｏｄｉｕｍ?ｄｏｄｅｃｙｌ?ｓｕｌｆａｔｅ?ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ?ｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ｐｒｏｔｅｉｎ??２．....

圖２．５溫度對／？々Ｅｓｔｌ活性的影響??Ｆｉｇｕｒｅ?２．５?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?化ｍｐｅｒａｔｕｒｅ?ｏｎ?ａｃｔｉｖｉｔｙ?ｏｆ?ｐｕｒｉｆｉｅｄ?Ｗ＆Ｅｓｔｌ．??

圖２．５溫度對／？々Ｅｓｔｌ活性的影響??Ｆｉｇｕｒｅ?２．５?Ｅｆｆｅｃｔ?ｏｆ?化ｍｐｅｒａｔｕｒｅ?ｏｎ?ａｃｔｉｖｉｔｙ?ｏｆ?ｐｕｒｉｆｉｅｄ?Ｗ＆Ｅｓｔｌ．??隨后分別在３０、４０和５０°Ｃ條件下考察了Ｗ；Ｅｓｔｌ的溫度穩(wěn)定性，其失活曲線見圖２．６，??在３０、４０和....

本文編號：3907870