發(fā)布時(shí)間：2017-05-09 14:17

  本文關(guān)鍵詞：海洋來(lái)源免疫抑制劑Fumigaclavine C的發(fā)酵過(guò)程研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：麥角類(lèi)生物堿Fumigaclavine C (FC)是由海蟹共生煙曲霉(Aspergillus fumigatus)中分離得到的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物。文獻(xiàn)報(bào)道它具有同臨床一線(xiàn)用藥環(huán)孢菌素A相當(dāng)?shù)目寡酌庖咭种苹钚?是一種潛在的免疫抑制劑候選藥物。但FC較低的發(fā)酵水平制約了其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。為解決這一問(wèn)題,本文擬通過(guò)對(duì)海蟹共生煙曲霉發(fā)酵生產(chǎn)FC的生物過(guò)程進(jìn)行研究,探索不同發(fā)酵策略對(duì)海蟹共生煙曲霉生長(zhǎng)及代謝過(guò)程的影響,建立針對(duì)FC生物合成特點(diǎn)的發(fā)酵工藝,進(jìn)一步在反應(yīng)器水平進(jìn)行放大驗(yàn)證,為FC的規(guī)模化制備工藝開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ),并為FC后續(xù)的活性研究提供藥源保障。本文首先基于麥角類(lèi)生物堿與煙曲霉分生孢子間的相關(guān)性,建立了一種由液體振蕩培養(yǎng)與靜置培養(yǎng)相結(jié)合二階段發(fā)酵工藝。在該工藝下,促進(jìn)了海蟹共生曲霉在液態(tài)發(fā)酵中的分生孢子產(chǎn)量,并發(fā)現(xiàn)FC的生物合成與分生孢子形成在動(dòng)力學(xué)上具有相關(guān)性。進(jìn)一步采用Box-Behnken設(shè)計(jì)及響應(yīng)面模型分析方法對(duì)二階段發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化,得到振蕩培養(yǎng)及靜置培養(yǎng)的最佳持續(xù)時(shí)間分別為4.5及8天,過(guò)程最優(yōu)溫度為28℃,在此條件下,FC最高產(chǎn)量可達(dá)62.7 mg/L,為文獻(xiàn)報(bào)道最高值的3倍。在二階段發(fā)酵工藝基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步考察了超聲刺激對(duì)海蟹共生煙曲霉發(fā)酵過(guò)程的影響。發(fā)現(xiàn)在振蕩培養(yǎng)階段進(jìn)行超聲刺激同樣能有效提高分生孢子的數(shù)量及FC的產(chǎn)量。通過(guò)單因素優(yōu)化優(yōu)化,得到適合FC生物合成的超聲刺激條件為振蕩培養(yǎng)12h后進(jìn)行超聲,超聲持續(xù)10 min,每隔24 h超聲一次直至靜置發(fā)酵階段開(kāi)始。在此條件下,FC最高產(chǎn)量達(dá)到118.1 mg/L。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),超聲能夠通過(guò)提高底物利用效率及初級(jí)代謝水平,促進(jìn)丙酮酸積累,從而提高FC產(chǎn)量。為了使FC的發(fā)酵工藝滿(mǎn)足規(guī)模化生產(chǎn)要求,我們重新篩選了發(fā)酵培養(yǎng)基并考察了糖蜜作為FC生物合成廉價(jià)底物的可行性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在培養(yǎng)基中添加糖蜜(100g/L)后,海蟹共生曲霉的產(chǎn)孢能力及FC生物合成得到了顯著提高,并且降低了其他代謝產(chǎn)物的積累。通過(guò)對(duì)發(fā)酵過(guò)程的進(jìn)一步優(yōu)化,利用糖蜜制備種子液用于FC發(fā)酵,最終使FC最高產(chǎn)量達(dá)到226.9 mg/L。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),糖蜜能顯著提升海蟹共生煙曲霉的代謝水平,促進(jìn)丙酮酸積累并通過(guò)上調(diào)HMG-CoA還原酶(HMGR)活性來(lái)促進(jìn)FC的生物合成。在完善了搖瓶水平FC發(fā)酵工藝之后,我們進(jìn)一步將二階段發(fā)酵工藝在反應(yīng)器水平進(jìn)行放大驗(yàn)證。利用攪拌釜反應(yīng)器及靜置反應(yīng)器將二階段發(fā)酵的振蕩培養(yǎng)及靜置培養(yǎng)階段均成功在反應(yīng)器水平再現(xiàn)。并分別利用槳葉末端線(xiàn)速度相似及單位體積發(fā)酵液氣液接觸面積(Agas-liq)相似的原則,將振蕩培養(yǎng)及靜置培養(yǎng)階段均在反應(yīng)器水平進(jìn)行了放大。在不同反應(yīng)器水平中FC的產(chǎn)量均能達(dá)到200 mg/L以上,成功再現(xiàn)了搖瓶中FC的發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程,為后續(xù)規(guī)�；l(fā)酵工藝的開(kāi)發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：海蟹共生煙曲霉 Fumigaclavine C 分生孢子 二階段培養(yǎng) 超聲發(fā)酵 糖蜜
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：TQ920.6
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 第1章 緒論12-26
• 1.1 海洋來(lái)源藥物研究現(xiàn)狀12-15
• 1.2 海洋微生物及其天然產(chǎn)物15-17
• 1.2.1 海洋來(lái)源細(xì)菌15-16
• 1.2.2 海洋來(lái)源藍(lán)細(xì)菌16
• 1.2.3 海洋來(lái)源真菌16-17
• 1.3 麥角類(lèi)生物堿17-19
• 1.3.1 麥角類(lèi)生物堿的生物活性17-18
• 1.3.2 麥角類(lèi)生物堿的生產(chǎn)18-19
• 1.4 麥角類(lèi)生物堿Fumigaclavine C(FC)的研究進(jìn)展19-21
• 1.4.1 FC的生物活性19-20
• 1.4.2 FC的生物合成20-21
• 1.5 曲霉分生孢子的研究進(jìn)展21-24
• 1.5.1 曲霉分生孢子的形成過(guò)程21-23
• 1.5.2 影響曲霉分生孢子形成的因素23-24
• 1.6 研究的目標(biāo)、意義和具體研究?jī)?nèi)容24-26
• 1.6.1 研究的目標(biāo)和意義24
• 1.6.2 具體研究?jī)?nèi)容24-26
• 第2章 二階段培養(yǎng)對(duì)FC發(fā)酵過(guò)程的影響26-46
• 2.1 前言26
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料及方法26-36
• 2.2.1 試劑與儀器26-27
• 2.2.2 培養(yǎng)基27-29
• 2.2.3 菌株及培養(yǎng)條件29
• 2.2.4 二階段發(fā)酵培養(yǎng)條件29
• 2.2.5 分析方法29-36
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論36-45
• 2.3.1 不同培養(yǎng)方式對(duì)海蟹共生煙曲霉菌體形態(tài)的影響36-37
• 2.3.2 不同培養(yǎng)方式對(duì)FC發(fā)酵過(guò)程的影響37-40
• 2.3.3 二階段發(fā)酵工藝的響應(yīng)面模型優(yōu)化40-43
• 2.3.4 代謝途徑調(diào)控對(duì)FC生物合成的影響43-45
• 2.4 本章小結(jié)45-46
• 第3章 超聲刺激對(duì)FC發(fā)酵過(guò)程的影響46-60
• 3.1 前言46
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料及方法46-51
• 3.2.1 試劑與儀器46-47
• 3.2.2 培養(yǎng)基47-48
• 3.2.3 菌株及培養(yǎng)條件48
• 3.2.4 二階段發(fā)酵培養(yǎng)條件48
• 3.2.5 分析方法48-51
• 3.3 結(jié)果與討論51-59
• 3.3.1 超聲刺激起始時(shí)間對(duì)FC發(fā)酵的影響51-52
• 3.3.2 超聲刺激持續(xù)時(shí)間對(duì)FC發(fā)酵的影響52-53
• 3.3.3 超聲刺激頻度對(duì)FC發(fā)酵的影響53
• 3.3.4 超聲刺激對(duì)FC的發(fā)酵過(guò)程的影響53-55
• 3.3.5 超聲刺激對(duì)FC發(fā)酵過(guò)程菌體形態(tài)的影響55-57
• 3.3.6 超聲刺激對(duì)FC發(fā)酵過(guò)程有機(jī)酸代謝的影響57-59
• 3.4 本章小結(jié)59-60
• 第4章 糖蜜對(duì)FC發(fā)酵過(guò)程的影響60-75
• 4.1 前言60
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料及方法60-64
• 4.2.1 試劑與儀器60-62
• 4.2.2 培養(yǎng)基62
• 4.2.3 菌株及培養(yǎng)條件62
• 4.2.4 二階段發(fā)酵培養(yǎng)條件62
• 4.2.5 分析方法62-64
• 4.3 結(jié)果與討論64-74
• 4.3.1 適合FC規(guī)�；a(chǎn)的培養(yǎng)基篩選64-65
• 4.3.2 糖蜜對(duì)海蟹共生煙曲霉分生孢子形成及次級(jí)代謝的影響65-67
• 4.3.3 糖蜜濃度對(duì)FC發(fā)酵過(guò)程的影響67-70
• 4.3.4 糖蜜對(duì)FC發(fā)酵過(guò)程中有機(jī)酸代謝的影響70-71
• 4.3.5 糖蜜對(duì)FC發(fā)酵過(guò)程中HMG-CoA還原酶的影響71-72
• 4.3.6 利用糖蜜制備種子發(fā)酵液對(duì)FC發(fā)酵過(guò)程的影響72-74
• 4.4 本章小結(jié)74-75
• 第5章 FC發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程在反應(yīng)器水平的放大驗(yàn)證75-85
• 5.1 前言75
• 5.2 實(shí)驗(yàn)材料及方法75-78
• 5.2.1 試劑與儀器75-76
• 5.2.2 培養(yǎng)基76
• 5.2.3 菌株及培養(yǎng)條件76-77
• 5.2.4 反應(yīng)器水平發(fā)酵77-78
• 5.2.5 分析方法78
• 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果78-84
• 5.3.1 第一階段發(fā)酵在反應(yīng)器水平的工藝建立78-80
• 5.3.2 第二階段發(fā)酵在反應(yīng)器水平的工藝建立80-81
• 5.3.3 FC最優(yōu)工藝下實(shí)驗(yàn)室規(guī)模反應(yīng)器發(fā)酵81-83
• 5.3.5 FC中試規(guī)模反應(yīng)器發(fā)酵放大驗(yàn)證83-84
• 5.4 本章小結(jié)84-85
• 第6章 結(jié)論與展望85-88
• 6.1 主要結(jié)論85-86
• 6.2 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)86
• 6.3 展望86-88
• 參考文獻(xiàn)88-98
• 致謝98-99
• 攻讀博士期間的成果99

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