阿爾茲海默癥(Alzheimer's Disease,AD)作為一種典型的神經(jīng)退行性疾病,其病理特征主要表現(xiàn)為患者腦部老年斑大量形成及神經(jīng)原纖維纏結(jié)。其中,老年斑主要由β-淀粉樣蛋白(Amyloidβ-protein,Aβ)及Zn~(2+)、Fe~(3+)、Cu~(2+)等金屬離子組成。隨著全球老齡化的日益嚴(yán)重,AD對(duì)人類健康的危害也愈演愈烈。迄今為止,AD的發(fā)病機(jī)理依舊沒有明確的解析,同時(shí)也缺少有效的治療手段阻止或逆轉(zhuǎn)疾病。因此,神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的金屬離子及Aβ斑塊的研究是AD病理特征解析及治療的關(guān)鍵。光譜分析是神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的金屬離子與Aβ斑塊的重要研究手段。一方面,針對(duì)重要的金屬離子,利用雙光子比率型熒光探針穿透能力強(qiáng)、背景信號(hào)低及組織損傷小的優(yōu)點(diǎn),可實(shí)現(xiàn)金屬離子的生物傳感。金屬離子能影響Aβ蛋白的折疊與聚集,進(jìn)而影響老年斑的產(chǎn)生、生長(zhǎng)及其結(jié)構(gòu)。因此,另一方面,利用偏光分析可進(jìn)一步解析Aβ斑塊的結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)機(jī)制及金屬離子、抑制劑等對(duì)其生長(zhǎng)過程的影響。然而,實(shí)現(xiàn)金屬離子的熒光分析及Aβ斑塊相關(guān)的偏光分析仍然具有挑戰(zhàn)。目前的挑戰(zhàn)主要在以下三個(gè)方面:(1)實(shí)現(xiàn)腦切片及斑馬魚中金屬離子的生物傳感,需構(gòu)建高雙光子吸收截面(100 GM)的探針;(2)已報(bào)道的雙光子比率型金屬離子熒光探針大多需要加入大量的有機(jī)溶劑,為了更好地將探針用于生物傳感,需提高探針的水溶性;(3)在淀粉樣蛋白堆積球晶的研究中,偏光分析的巨大潛力遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有得到發(fā)揮,亟需建立完整、系統(tǒng)的Aβ斑塊偏光分析研究。本論文就上述提出的關(guān)鍵科學(xué)問題,展開了以下三個(gè)工作:(1)為了獲取更高的雙光子吸收截面,我們合成了具有高選擇性、高時(shí)空分辨率的雙光子比率型探針5,5-bis((E))-4-((2,5,8,11-tetraoxatridecan-13-yl)oxy)-3,5 dimethylstyryl)-2,2′-bipyridine(P-Zn)。P-Zn探針與Zn~(2+)作用后,雙光子吸收截面最大值由516±77 GM增至958±144 GM。P-Zn探針也具有高穩(wěn)定性、低毒性以及良好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)。通過AD鼠腦切片和正常鼠腦切片的熒光成像對(duì)比,發(fā)現(xiàn)AD鼠腦切片中存在明顯的斑塊,且該斑塊中Zn~(2+)的含量高于正常鼠腦。(2)為了克服探針?biāo)苄圆畹娜秉c(diǎn),我們使用二甲基吡啶胺的衍生物作為Zn~(2+)的絡(luò)合劑,合成了具有較高水溶性、高選擇性的雙光子比率型熒光探針(E)-1-(6-(4-(2-(2-(2-methoxyethoxy)ethoxy)eth-oxy)-3,5-dimethylstyryl)quinolin-2-yl)-N,N-bis(pyridin-2-ylmethyl)methanamine(TEO-MPVQ)。TEO-MPVQ探針具有組織穿透能力強(qiáng)、生物損傷小及響應(yīng)時(shí)間短等特性。神經(jīng)元成像表明NO刺激下,內(nèi)源性Zn~(2+)會(huì)從神經(jīng)元中的金屬硫蛋白迅速釋放,減小細(xì)胞內(nèi)Zn~(2+)的濃度。(3)金屬離子與Aβ斑塊的形成密切相關(guān),我們系統(tǒng)地研究了Aβ斑塊的結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)機(jī)制及金屬離子等關(guān)鍵生物分子離子對(duì)其生長(zhǎng)過程的影響。研究表明,Aβ斑塊在患者腦中以球晶的形式存在。通過溶劑揮發(fā)法制備得到大量Aβ_(1-16)球晶,證實(shí)Aβ_(1-16)球晶是由Aβ纖維堆積組成的。穆勒矩陣偏光成像研究表明,Aβ_(1-16)球晶的線性雙折射角度與球晶中纖維的快速生長(zhǎng)方向平行。Zn~(2+)及Cu~(2+)通過成核作用及配位作用兩種方式影響Aβ_(1-16)球晶的生長(zhǎng),使Aβ_(1-16)球晶的生長(zhǎng)速度隨Zn~(2+)及Cu~(2+)的濃度的改變,出現(xiàn)先增大后減小的現(xiàn)象。為進(jìn)一步探究外源物質(zhì)與纖維的相互作用,考察了大量染料分子在球晶中的排列,證實(shí)羅丹明B等染料均沿球晶徑向排列。進(jìn)一步推測(cè)抑制劑主要通過與Aβ纖維徑向之間相互作用,從而減慢Aβ纖維徑向方向生長(zhǎng),降低球晶生長(zhǎng)速度。
【學(xué)位單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R749.16;O657.3
【部分圖文】：

華東師范大學(xué)博士學(xué)位論文2p25片段，該片段激活會(huì)激酶，引起Tau蛋白過度磷酸化進(jìn)而導(dǎo)致AD中出現(xiàn)NFTs。[13-15]老年斑是由細(xì)胞外β-淀粉樣蛋白（Amyloidβ-protein，Aβ）的沉積及相關(guān)的軸突和樹突損傷引起的，主要分布在邊緣皮質(zhì)和締合皮質(zhì)。[16]正常情況下機(jī)體內(nèi)Aβ的產(chǎn)生和降解是平衡的，一旦淀粉樣前體蛋白（AmyloidPrecursorProtein，APP）相關(guān)的酶的功能異�；蚧蛲蛔儯蜁�(huì)導(dǎo)致Aβ的產(chǎn)生快于Aβ的清除，最終引起Aβ的堆積，形成早期老年斑。早期老年斑對(duì)神經(jīng)細(xì)胞而言具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性，最終會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元的變性和功能障礙。突觸功能紊亂也與老年斑的產(chǎn)生密切相關(guān)，[17]如圖1.1所示，APP在突觸前末梢的囊泡中形成Aβ，過量的Aβ會(huì)與突觸后的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白、乙酰膽堿、蛋白激酶B等受體結(jié)合，進(jìn)而引起神經(jīng)遞質(zhì)在突觸間的傳遞受阻，使得突觸后端末梢的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)作用減弱，長(zhǎng)時(shí)程抑制作用增強(qiáng)，突觸強(qiáng)度降低，學(xué)習(xí)和記憶能力下降，最終產(chǎn)生AD。[18-22]Aβ級(jí)聯(lián)假說是目前該疾病致病機(jī)理的主要假說，研究發(fā)現(xiàn)Aβ形成纖維狀聚集后具有神經(jīng)毒性，進(jìn)一步會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激作用及炎癥損傷，且生物體內(nèi)，Aβ積累先于并驅(qū)動(dòng)Tau蛋白的聚集。[23]因此，Aβ的研究對(duì)老年斑結(jié)構(gòu)及形成機(jī)制的解析及AD的治療有著極其重要的意義。圖1.1AD中的突觸紊亂行為。1.1.2阿爾茲海默癥相關(guān)物質(zhì)AD的病理過程中伴隨著錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)的堆積、氧化應(yīng)激及炎癥損傷，

華東師范大學(xué)博士學(xué)位論文3這些過程會(huì)更進(jìn)一步導(dǎo)致能量衰竭和突觸功能障礙。Aβ、Tau蛋白、活性氧（ReactiveOxygenSpecies，ROS）、活性氮（ReactiveNitrogenSpecies，RNS）及金屬離子在這些過程中發(fā)揮著十分重要的作用。（1）老年斑形成過程中的β-淀粉樣蛋白Aβ是代謝的天然產(chǎn)物，由36-43個(gè)氨基酸組成。人體內(nèi)Aβ1-40單體比易聚集且生物損傷大的Aβ1-42單體普遍得多。[24]如圖1.2所示，APP通過β-淀粉樣前體蛋白裂解酶1（Beta-siteAmyloidPrecursorProtein–CleavingEnzyme1，BACE-1）、β-分泌酶、γ-分泌酶及早老素1的蛋白質(zhì)復(fù)合物等一系列酶促作用水解產(chǎn)生Aβ。[25]通過唐氏綜合征等遺傳性疾病及Aβ1-42細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，Aβ的產(chǎn)生和清除不平衡，會(huì)導(dǎo)致多肽聚集，進(jìn)而導(dǎo)致Aβ積累，該過程可以認(rèn)為是AD的起因之一。[26-27]Aβ會(huì)自發(fā)地聚集成多種形式共存的物理狀態(tài)，其中一種形式由寡聚體（2至6個(gè)多肽）組成的聚集中間體。該中間體經(jīng)過進(jìn)一步堆積可形成具有β-折疊結(jié)構(gòu)的片狀結(jié)構(gòu)，進(jìn)而形成早期老年斑。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，相比于老年斑，可溶性寡聚體（二聚體和三聚體）及聚集中間體具有更強(qiáng)的神經(jīng)毒性，[28-29]且AD中認(rèn)知缺陷的嚴(yán)重程度也與寡聚體的含量有密切關(guān)系，[30]因此，Aβ的研究對(duì)老年斑的結(jié)構(gòu)及形成機(jī)制的解析具有著重要的指導(dǎo)作用。圖1.2Aβ的產(chǎn)生過程。（2）神經(jīng)原纖維纏結(jié)過程中的Tau蛋白NFTs的主要成分是聚集的過度磷酸化的Tau蛋白。[31]如圖1.3所示，四個(gè)重復(fù)序列（R1-R4）可組成Tau蛋白與微管結(jié)合域（Microtubule-BindingDomain，

華東師范大學(xué)博士學(xué)位論文4MBD）。正常情況下，Tau蛋白的軸突中含有豐富的可溶性蛋白，可促進(jìn)微管的組裝及囊泡的穩(wěn)定性運(yùn)輸。而高度磷酸化的Tau蛋白不溶，對(duì)微管缺乏親和力，并且會(huì)締合成成對(duì)的螺旋結(jié)構(gòu)。添加去磷酸鹽殘基的酶可調(diào)節(jié)Tau蛋白磷酸化的程度。與Aβ低聚物一樣，Tau蛋白的中間聚集體也具有細(xì)胞毒性并會(huì)損傷認(rèn)知。[32-33]過度磷酸化的Tau蛋白中T181和T231氨基酸殘基及腦脊液Tau蛋白的總含量可以作為具有輕度認(rèn)知障礙的早期AD患者的生物標(biāo)志[34]。圖1.3Tau蛋白的產(chǎn)生機(jī)制和功能。（3）氧化應(yīng)激過程中的活性氧、活性氮及金屬離子AD中功能異常的線粒體會(huì)釋放氧化自由基引起氧化應(yīng)激。[35-36]如圖1.4所示，Aβ可作為ROS和RNS有效產(chǎn)生劑。[37]線粒體中的過氧化氫（H2O2）會(huì)擴(kuò)散到細(xì)胞質(zhì)中，并參與到金屬離子催化的羥基自由基（·OH）形成過程中。[38]受刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞是一氧化氮（NO）的主要來源，這些ROS和RNS會(huì)破壞細(xì)胞中的分子靶標(biāo)。同時(shí)由磷脂膜的過氧化產(chǎn)生的有毒的醛類會(huì)損害線粒體酶。而細(xì)胞中的其他必需蛋白會(huì)直接被氧化，生成羰基和硝化衍生物。隨后，磷脂膜對(duì)鈣離子（Ca2+）的滲透性增加，進(jìn)而導(dǎo)致其他離子失衡及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)受損，
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