乳酸是一種天然存在的有機(jī)酸,廣泛用于食品、化工、醫(yī)藥等行業(yè)。近年來(lái),隨著全球環(huán)保意識(shí)的不斷加強(qiáng),聚乳酸產(chǎn)品作為傳統(tǒng)化石來(lái)源塑料的替代品,更是大大帶動(dòng)了全球范圍對(duì)乳酸的需求。本論文以潛在工業(yè)生產(chǎn)菌擬干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)為研究對(duì)象,針對(duì)目前微耗氧乳酸發(fā)酵過(guò)程中氧代謝表征與控制難、發(fā)酵效率低、副產(chǎn)物含量高等突出問(wèn)題,以細(xì)胞生理生化響應(yīng)、關(guān)鍵酶活性檢測(cè)、代謝輪廓和微觀代謝流分析以及發(fā)酵液流變特性變化為指導(dǎo),依據(jù)多尺度參數(shù)相關(guān)分析方法,深入挖掘發(fā)酵過(guò)程中氧代謝的作用機(jī)制,并詳細(xì)解析了環(huán)境變量對(duì)細(xì)胞宏觀和微觀代謝的影響,從而理性指導(dǎo)擬干酪乳桿菌乳酸發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)了高糖濃度下,提高乳酸產(chǎn)量、產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率的目的。本文首先研究了擬干酪乳桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸過(guò)程中的基本生理特性。發(fā)現(xiàn)(1)擬干酪乳桿菌在微耗氧條件下通過(guò)同型乳酸發(fā)酵代謝葡萄糖；(2)乳酸合成與菌體生長(zhǎng)密切相關(guān),其生長(zhǎng)相關(guān)系數(shù)達(dá)到6.23,非生長(zhǎng)相關(guān)系數(shù)為0.18；(3)中和劑添加量與乳酸合成量具有良好的線性關(guān)系,從而可以用于過(guò)程關(guān)鍵參數(shù)在線監(jiān)測(cè)的實(shí)現(xiàn)；(4)生理參數(shù)二氧化碳釋放速率(CER)與菌體生長(zhǎng)速率具有很高的相關(guān)性,通過(guò)CER和呼吸商(RQ)能夠有效指導(dǎo)發(fā)酵過(guò)程中分階段氮源添加的優(yōu)化策略,優(yōu)化后使得產(chǎn)率和轉(zhuǎn)化率分別提高5.94%和3.05%,副產(chǎn)物乙偶姻和乙酸含量分別下降24.68%和31.25%。其次,系統(tǒng)研究了擬干酪乳桿菌對(duì)氧代謝的代謝生化響應(yīng)機(jī)理以及兩階段氧攝取速率(OUR)控制策略。由于乳酸發(fā)酵過(guò)程為微耗氧發(fā)酵過(guò)程,常規(guī)氧代謝表征參數(shù)溶氧(DO)和氧化還原電位(ORP)都存在明顯的缺點(diǎn),發(fā)酵液中DO往往低于電極的檢測(cè)限,而后者很大程度上還受氧氣以外其他具有氧化還原性化合物的影響。因此,在本文中利用過(guò)程尾氣質(zhì)譜分析技術(shù)首次將生理參數(shù)OUR引入到微耗氧乳酸發(fā)酵過(guò)程中用以定量表征菌體氧代謝。并根據(jù)氧代謝的特性,通過(guò)常規(guī)操作參數(shù)通氣量來(lái)調(diào)節(jié)菌體的氧代謝水平,用于研究其對(duì)菌體生長(zhǎng)和生理代謝的影響。具體研究結(jié)果如下：(1)發(fā)酵過(guò)程中,氧的消耗主要依賴于NADH氧化酶和電子傳遞鏈(ETC),而且前者主要作用于生長(zhǎng)前期,而生長(zhǎng)后期和穩(wěn)定期則更多依賴于后者；(2)保證乳酸同型發(fā)酵的前提下(轉(zhuǎn)化率大于80%),高OUR水平能夠促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)、葡萄糖代謝和乳酸合成,但是降低乳酸轉(zhuǎn)化率；(3)在生長(zhǎng)期,隨著OUR水平的升高,總體丙酮酸代謝產(chǎn)生乙酰輔酶A的通量大大增加,造成乳酸轉(zhuǎn)化率的明顯下降,同時(shí)低OUR水平下丙酮酸主要通過(guò)PFL生成乙酰輔酶A,而高OUR水平下,丙酮酸通過(guò)丙酮酸脫氫酶系(PDH)產(chǎn)生乙酰輔酶A的比例顯著上升；(4)高OUR水平使得NAD。再生能力更加靈活,而且高產(chǎn)ATP(相對(duì)于乳酸合成途徑)的乙酸途徑明顯加強(qiáng),因此促進(jìn)葡萄糖代謝通量增加以及對(duì)能量的合成用于菌體生長(zhǎng)；(5)生長(zhǎng)期OUR水平對(duì)丙酮酸代謝的變化主要通過(guò)乙酰輔酶A節(jié)點(diǎn)的通量比例來(lái)體現(xiàn),從而實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)氧化還原環(huán)境(NAD+/NADH比例)的調(diào)節(jié)。(6)進(jìn)入穩(wěn)定期后,胞內(nèi)代謝輪廓和關(guān)鍵酶酶活分析表明3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)是控制糖酵解途徑通量的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),而高OUR水平會(huì)加劇胞內(nèi)ROS水平的升高,并嚴(yán)重抑制GAPDH的活性,從而大大降低葡萄糖代謝水平；(7)葡萄糖代謝通量的減小和乳酸轉(zhuǎn)化率的下降這兩個(gè)方面共同作用是造成高OUR水平下乳酸產(chǎn)率低的原因,而且丙酮酸合成乳酸途徑的調(diào)控發(fā)生在代謝水平(胞內(nèi)更低的NADH水平和高NAD+/NADH比例)而不是酶學(xué)水平(乳酸脫氫酶的活性基本不變)；(8)胞內(nèi)代謝通量分布表明同生長(zhǎng)期一樣,OUR水平仍作用于丙酮酸代謝,但是此時(shí)對(duì)于胞內(nèi)NADH和NAD’平衡的調(diào)節(jié)更依賴于乙偶姻節(jié)點(diǎn)的作用,而不是乙酰輔酶A節(jié)點(diǎn)；(9)分析胞內(nèi)NADH利用情況發(fā)現(xiàn),高OUR水平下乳酸的NADH利用效率顯著下降,從94.5%下降到84.5%,而副產(chǎn)物途徑以及電子傳遞鏈的利用則增加；(10)ATP合成效率和組成比例的分析表明高OUR下菌體對(duì)ATP更為依賴,同時(shí)更多通過(guò)副產(chǎn)物和電子傳遞鏈途徑來(lái)高產(chǎn)ATP,從而來(lái)響應(yīng)更強(qiáng)的氧化應(yīng)激�；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果,我們建立了兩階段OUR控制策略,使得乳酸產(chǎn)率較單OUR控制(0.14mmol/L/h)提高了12.7%,而且乳酸轉(zhuǎn)化率也比0.43mmol/L/h提高了4.04%。此外,發(fā)酵液流變特性顯著影響氣泡大小分布,氧傳遞系數(shù)(kLa)和氧傳遞速率(OTR)。因此氫氧化鈣作為中和劑時(shí)發(fā)酵表現(xiàn)優(yōu)于氨水和氫氧化鈉是因?yàn)榇藯l件下菌體具有更高的氧代謝水平。本論文還研究了滲透壓和中和劑對(duì)乳酸合成的影響機(jī)理。高糖濃度乳酸發(fā)酵過(guò)程中中和劑不僅影響菌體氧代謝水平,更主要體現(xiàn)在環(huán)境滲透壓的差異上。乳酸鈣低溶解度和乳酸銨高滲透壓是限制發(fā)酵后期高效生產(chǎn)的主要原因,并不是NH4’或LA。以及乳酸分子的積累。通過(guò)搖瓶和5 L發(fā)酵罐驗(yàn)證,存在三個(gè)顯著影響擬干酪乳桿菌生長(zhǎng)和代謝的滲透壓水平。當(dāng)滲透壓低于1800 mOsm/kg時(shí),菌體生長(zhǎng)和代謝不受影響；處于1 800-3000 mOsm/kg時(shí),菌體生長(zhǎng)受到一定程度抑制,但是代謝基本沒(méi)有影響；大于3000mOsm/kg時(shí),菌體生長(zhǎng)和代謝都受到顯著抑制；一旦滲透壓達(dá)到3600 mOsm/kg時(shí),菌體生長(zhǎng)和代謝都幾近停止。時(shí)序測(cè)定細(xì)胞膜脂肪酸組成的變化發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵的進(jìn)行(滲透壓不斷升高),細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸／飽和脂肪酸的比例大大上升,而且其中環(huán)氧脂肪酸含量也明顯升高。胞內(nèi)代謝物圖譜則表明EMP、TCA、PPP途徑的各中間代謝物含量明顯下降,而幾種可能存在的潛在滲透壓保護(hù)劑(甘油,甘露醇,脯氨酸和天冬氨酸)含量則顯著上升。通過(guò)搖瓶和上罐驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)外源添加2 g/L脯氨酸,細(xì)胞能夠通過(guò)外源攝取并在胞內(nèi)積累來(lái)抵抗高滲應(yīng)激,但是脯氨酸的保護(hù)效果具有一定的作用范圍(3000-3600 mOsm/kg),一旦當(dāng)環(huán)境滲透壓高于菌體的耐受閡值(擬干酪乳桿菌為3600mOsm/kg左右)時(shí),其效果大大減弱。除此之外,過(guò)程控制策略也能有效緩解發(fā)酵后期的高滲應(yīng)激。本研究中開發(fā)的中和劑組合策略不但避免了高乳酸鈣濃度引起的結(jié)晶,而且大大降低了環(huán)境滲透壓。結(jié)果表明此策略下乳酸產(chǎn)率較單獨(dú)氨水作中和劑時(shí)的產(chǎn)率提高了2.21倍,而且乳酸轉(zhuǎn)化率也略有提升。最后,探索了新型基因編碼熒光探針Frex在檢測(cè)擬干酪乳桿菌胞內(nèi)NADH中的應(yīng)用。鑒于輔因子NADH在乳酸發(fā)酵過(guò)程中的重要作用,但是對(duì)其實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài),并且高時(shí)空分辨的檢測(cè)仍是一個(gè)重大難題。本文應(yīng)用楊弋教授課題組開發(fā)的一種基因編碼熒光探針(Frex),將其首次導(dǎo)入到乳酸菌中,并進(jìn)行初步的應(yīng)用。雖然重組菌在代謝強(qiáng)度上要弱于原始菌,但仍能夠有效表征原始菌在乳酸發(fā)酵過(guò)程中的生長(zhǎng)和代謝特性。各種環(huán)境應(yīng)激擾動(dòng)的結(jié)果(包括輔因子、葡萄糖、丙酮酸、魚藤酮和環(huán)境ORP),證實(shí)了Frex探針對(duì)NADH的特異性響應(yīng),以及其在擬干酪乳桿菌中應(yīng)用的可行性。同時(shí)將Frex探針應(yīng)用到實(shí)際乳酸發(fā)酵(不同OUR水平)的過(guò)程檢測(cè)中,再一次證明了氧代謝水平在乳酸發(fā)酵過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)作用。同時(shí)我們也希望Frex探針作為一種強(qiáng)有力的NADH活體檢測(cè)手段廣泛應(yīng)用到其它生物過(guò)程中。
【學(xué)位單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：TQ921.3
【部分圖文】：

?－ｌｉｍｅ（ｈ）??圖４．２不同ＯＵＲ水平下，ＤＯ和ＯＲＰ?（Ａ）、ＯＵＲ?（Ｂ）、ＮＡＤＨ氧化酶活性（Ｃ）和單位菌體??電子傳遞鏈還原能力（Ｄ）隨發(fā)酵時(shí)間的變化。圖４．２Ｄ中所有值通過(guò)測(cè)定產(chǎn)生的化ｒｎｉａｚａｎ濃度表??征，并！＾＾不通氣條件下〇？１值作為對(duì)照??Ｆｉｇ．?４．２?Ｐ陽(yáng)ｆｉｌｅｓ?ｏｆ?ＤＯ?ａｎｄ?ＯＲＰ?（Ａ），ＯＵＲ?（Ｂ），?ＮＡＤＨ?ｏｘｉｄａｓｅ?ａｃｔｉｖｉｔｙ?（Ｃ）?ａｎｄ?ｓｐｅｃｉｆｉｃ?ＥＴＣ?ｒｅｄｕｃｉｎｇ??ｃａｐａｃｉｔｙ?（Ｄ）?ｕｎｄｅｒ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ＯＵＲ?ｌｅｖｅｌｓ?ｄｕｒｉｎｇ?ｔｈｅ?ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ?ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．?Ａｌｌ?ｖａｌｕｅｓ?ｉｎ?Ｆｉｇ．?４．２Ｄ??ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ?化ｅ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ｆｏｒｍａｚａｎ?ｐｅｒ?ｇｒａｍ?ＤＣＷ?ｗｅｒｅ?ｒｅｐｏｒｔｅｄ?ａｓ?ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ?ｏｆ?ｖａｌｕｅ??ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ?ａｌ?０?ｈ?ｗｉｔｈ?ｎｏ?ａｅｒａｔｉｏｎ?ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ??在乳酸菌氧代謝中，由于細(xì)胞缺少完整的電子傳遞鏈，因此對(duì)于氧氣的消耗主要依??靠細(xì)胞質(zhì)中ＮＡＤＨ氧化酶。此外，部分電子傳遞鏈（主要為輔酶Ｑ和ＮＡＤＨ脫氨酶）??也被認(rèn)為能夠有效還原環(huán)境中氧氣。Ｔａｃｈｏｎ等人ｌｉｗｉ發(fā)現(xiàn)在￡ａ＂ｏｃｏｃｃｗｓ?／口Ｃ化中ＤＯ的??消耗主要依賴于ＮＡＤＨ氧化酶，而且部分電子傳遞鏈同時(shí)作用于除了?ＤＯ?Ｗ外的其它??氧化還原物質(zhì)。因此，我們時(shí)序測(cè)定了不同ＯＵ民下胞內(nèi)ＮＡＤＨ氧化酶活性和電子傳遞??鏈還原能力

頁(yè)?華東理工大學(xué)博±學(xué)位論的電子傳遞鏈，因此菌體能量的合成主要通過(guò)底物水平磯酸化來(lái)完成。當(dāng)葡萄成己酸時(shí)，１?ｍｏｌ葡萄糖的消耗伴隨４?ｍｏｌ?ＡＴＰ的生成，而乳酸合成只伴隨２?因此乙酸合成相對(duì)乳酸合成來(lái)說(shuō)是一個(gè)高產(chǎn)ＡＴＰ的過(guò)程。因此，在高ＯＵＲ胞用于生長(zhǎng)的能最利用率要高于低ＯＵＲ水平，從而能夠有效促進(jìn)生長(zhǎng)（圖４．５有報(bào)道也指出乙酸的合成與還原力的平衡有關(guān)，特別是涉及到與細(xì)胞生長(zhǎng)相ＰＨ。相比之下，不同ＯＵＲ水平下，甲酸合成量貝ＩＪ正好與乙酸相反（圖４．９８）。和丙廁酸甲酸裂解酶有關(guān)，這個(gè)酶對(duì)氧氣敏感，因此在低ＯＵＲ水平下甲酸的高，同時(shí)丙剛酸在甲酸裂解酶和丙酬酸脫氨酶復(fù)合體系作用下的產(chǎn)物都為乙醜作為前體進(jìn)入到細(xì)胞的合成代謝中，包括ＴＣＡ循環(huán)Ｕ及細(xì)胞膜脂肪酸等，因水平更多的通過(guò)甲酸合成途徑來(lái)補(bǔ)償己醜輔酶Ａ的不足，從而滿足細(xì)胞生長(zhǎng)

?第巧頁(yè)??的代謝通量的比例，包括訊酸，石酸和己偶姻（圖４．１０）。Ｔａｈｖａｌｋａｒ和Ｋａｉｌａｓａｐａｔｈｙ［ｉ７ｉ］??在益生菌的研究中指出（Ｚａｃ／ｏｂａｃＷｗ?和公抑沁山ｍ?ｓｐｐ．），葡萄糖代謝??的終產(chǎn)物受氧濃度顯著影響。而Ｇａｒｒｉｇｕｅｓ?［７２］等人也報(bào)道稱，胞內(nèi)ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ比例是??控制Ｌ．?／ｆｌｃ化由同型乳酸發(fā)酵向異性乳酸發(fā)醇轉(zhuǎn)變的主要因素。本研究中ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ??比例的變化圖說(shuō)明穩(wěn)定期相對(duì)還原的環(huán)境更有利于細(xì)胞的代謝和現(xiàn)酸的合成，其中胞外??ＯＲＰ圖譜也從側(cè)面證實(shí)了這個(gè)結(jié)論。而且在我們Ｗ前通過(guò)ＯＲＰ控制擬干酪郭桿菌乳酸??生產(chǎn)乳酸的研巧工作中也發(fā)現(xiàn)環(huán)境０民Ｐ在－２５０?ｍＶ左右比在－１００?ｍＶ左右更有利于菌??體合成乳酸。另外，從能量角度分析可得，高ＯＵ民糖酵解速率的下降限制了能量的利??用效率，這就導(dǎo)致郭酸的產(chǎn)生不能快速有效的分泌到胞外，可能影響胞內(nèi)ｐＨ。一般來(lái)??說(shuō)，乳酸菌在有氧條件下合成乙酸和ｐＨ中性的立偶姻來(lái)代替乳酸是因?yàn)�；（１）乙酸�??合成伴隨ＡＴＰ的生成，可用于胞內(nèi)Ｈ＋的排出；（２）?ｐＨ中性的己偶姻合成能夠有效緩解??細(xì)胞的酸應(yīng)激；（３）?ＮＡＤ＋除了通過(guò)乳酸脫氨酶再生外還可Ｗ通過(guò)胞質(zhì)ＮＡＤＨ氧化酶
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本文編號(hào)：2866038