【摘要】：基因治療是將有治療作用的基因?qū)牖颊唧w內(nèi)的靶細(xì)胞來(lái)治療疾病的一種治療方法�；蛑委熥鳛橐环N新的疾病治療手段,受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注�；蛑委煹年P(guān)鍵問(wèn)題是如何將有治療作用的基因?qū)塍w內(nèi)靶細(xì)胞,這也是目前有待研究者們?nèi)ヌ剿鹘鉀Q的問(wèn)題。要解決這個(gè)問(wèn)題,就需要設(shè)計(jì)出安全、高效并具有靶向性的基因載體。主要的基因載體有病毒型和非病毒型兩種。目前,臨床上應(yīng)用較多的是病毒型基因載體,但很多病毒型基因載體都具有較大的毒性。非病毒型基因載體研究主要集中在陽(yáng)離子聚合物、脂質(zhì)體類(lèi)及多肽類(lèi)。雖然由于轉(zhuǎn)染效率較低和缺乏靶向性,使得非病毒型基因載體在實(shí)際應(yīng)用中受到一些限制,但隨著研究者們不斷地探索和努力,非病毒型基因載體的巨大潛力正在越來(lái)越多地被挖掘出來(lái)。我們合成的多苯并咪唑金屬配合物在一定條件下能夠誘導(dǎo)DNA發(fā)生凝聚,DNA凝聚體進(jìn)入細(xì)胞后,在胞內(nèi)具有較高的轉(zhuǎn)染效率。本工作合成了兩種多苯并咪唑1,1,4,7,7-五(2-苯并咪唑甲基)-二乙基三胺(DTPB)和N,N,N-三(2-苯并咪唑甲基)胺(NTB)。而后,采用DTPB和NTB及另外兩種多苯并咪唑N,N,N',N'-四(2’-苯并咪唑甲基)-1,2-乙二胺(EDTB)和N,N,N',N'-四(2-苯并咪唑甲基)反式-環(huán)己烷鄰苯二胺(CTB)為主配體,分別與兩種鈣金屬鹽及兩種錳金屬鹽反應(yīng)合成了4種鈣配合物[Ca(EDTB)NO3]NO3·3CH3OH、[Ca(EDTB)Ac]Ac、[Ca(CTB)(NO3)]NO3、 [Ca(NTB)(NO3)2C2H5OH]·2CH3CH2OH和兩種錳配合物[Mn(DTPB)Ac]Ac·8H2O、[Mn2(DTPB)(NO3)2H2O)2][Mn2(DTPB)(NO3)2·H2O·CH3OH](NO3)4.5CH3OH·H2O。我們利用紅外光譜儀和紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)對(duì)所合成的配體和配合物進(jìn)行了表征,并通過(guò)X-射線單晶衍射儀測(cè)定了這些配合物的晶體結(jié)構(gòu)。同時(shí),研究了它們誘導(dǎo)DNA凝聚的性質(zhì),并選擇其中的4種鈣配合物,研究了它們作為基因載體的功能。首先,我們采用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、粘度測(cè)定、直角光散射(RALS)、瓊脂糖凝膠電泳和激光動(dòng)態(tài)光散射(DLS)在溶液中測(cè)定了配合物和DNA的結(jié)合能力,分析了配合物濃度、DNA濃度和反應(yīng)體系的pH值等反應(yīng)條件對(duì)DNA凝聚的影響。結(jié)果表明：鈣和錳配合物都能夠凝聚DNA形成具有一定大小和形態(tài)并帶有表面電荷的凝聚體。根據(jù)粘度實(shí)驗(yàn)結(jié)果再結(jié)合紫外-可見(jiàn)光譜,推測(cè)出配合物與DNA的作用方式為：配合物分子先是通過(guò)靜電作用靠近并與DNA分子結(jié)合,當(dāng)兩者相距足夠近時(shí),配合物分子中的苯并咪唑基團(tuán)就會(huì)插入到DNA分子的堿基對(duì)之間形成π…π相互作用,此時(shí),配合物與DNA之間形成緊密的結(jié)合。配合物的DNA結(jié)合能力與配合物陽(yáng)離子帶有的正電荷數(shù)和苯并咪唑基團(tuán)數(shù)有關(guān)。配合物凝聚DNA的最佳pH范圍是7.0-8.0的近中性范圍,在pH為7.4時(shí),凝聚體粒徑隨配合物濃度增加、反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大。應(yīng)用透射電鏡(TEM)測(cè)定了DNA凝聚體的形貌。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著配合物濃度的增大,DNA凝聚體先是由結(jié)構(gòu)松散變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)致密,然后又由結(jié)構(gòu)致密的單個(gè)球狀凝聚體進(jìn)一步聚集成為大型樹(shù)狀凝聚體。KCl的存在,可以使原來(lái)顆粒較大的配合物-DNA凝聚體解聚成為顆粒較小的凝聚體。采用噻唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定了4種鈣配合物與DNA所形成凝聚體的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明,凝聚體的毒性小于配合物。在相同的實(shí)驗(yàn)條件下,鈣配合物-DNA凝聚體的毒性不到銅配合物([Cu(NTB)(H2O)]2+)-DNA凝聚體的一半,比鈷配合物([Co(NTB)Cl]+)-DNA凝聚體也低很多。同時(shí),鈣配合物-DNA凝聚體對(duì)正常細(xì)胞(COS-7細(xì)胞)的毒性低于對(duì)癌細(xì)胞(Hela細(xì)胞和Hep G2細(xì)胞)的毒性。在細(xì)胞跨膜實(shí)驗(yàn)中,在倒置熒光顯微鏡下觀察到凝聚體進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部。配合物與DNA摩爾比為1：2時(shí),由于所形成的凝聚體粒徑尺寸合適,所以細(xì)胞跨膜效率較高。熒光素酶和綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明：配合物雖然能夠介導(dǎo)外源基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá),但在同樣實(shí)驗(yàn)條件下其轉(zhuǎn)染效率比PEI低得多。當(dāng)配合物與DNA摩爾比為1：2時(shí),1,2-油�；字Ｒ掖及�(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphor ethanolamine, DOPE)輔助脂或一定濃度氯喹(N’,N’-二乙基-N4-(7-氯-4-喹啉基)-1,4-戊二胺二磷酸鹽,chloroquine, CQ)的添加能夠大大提高配合物的轉(zhuǎn)染效率；無(wú)論是否添加DOPE或CQ,凝聚體在正常細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率均高于在癌細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率。
【學(xué)位授予單位】：華中師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R450;O641.4

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本文編號(hào)：2747781