【摘要】：酶催化反應(yīng)具有顯著的高效性、催化專(zhuān)一性、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn),深入研究酶催化機(jī)理不僅有助于理解酶的生物學(xué)功能,還可為酶改造及應(yīng)用奠定良好的理論基礎(chǔ)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以對(duì)酶的結(jié)構(gòu)、反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和突變機(jī)制等方面進(jìn)行研究,但是由于蛋白酶結(jié)構(gòu)及催化過(guò)程的復(fù)雜性,在酶催化機(jī)理研究方面仍有許多問(wèn)題需要解決,例如僅憑實(shí)驗(yàn)方法無(wú)法系統(tǒng)地表征酶反應(yīng)中涉及到的中間體、過(guò)渡態(tài)的結(jié)構(gòu)以及各步基元反應(yīng)、決速步驟、能量學(xué)信息等。理論計(jì)算方法可以在分子水平上對(duì)酶催化反應(yīng)進(jìn)行研究,與實(shí)驗(yàn)方法得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行相互驗(yàn)證和補(bǔ)充。近年來(lái),計(jì)算酶學(xué)領(lǐng)域發(fā)展迅速,越來(lái)越多的研究者通過(guò)高性能計(jì)算進(jìn)一步揭示了酶催化過(guò)程的機(jī)制。隨著計(jì)算軟件的飛速發(fā)展以及理論計(jì)算方法的日趨完善,計(jì)算化學(xué)在大尺度生化體系研究中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛,現(xiàn)在已經(jīng)成為研究酶催化反應(yīng)機(jī)理的重要工具之一。本論文主要采用分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬、量子化學(xué)和分子力學(xué)結(jié)合方法(QM/MM)在原子水平上對(duì)幾類(lèi)含有輔因子的蛋白酶催化過(guò)程進(jìn)行深入研究,綜合運(yùn)用理論化學(xué)方法揭示這些酶催化過(guò)程中涉及的一些科學(xué)問(wèn)題,如底物在酶活性中心的結(jié)合模式及酶-底物復(fù)合物的活性狀態(tài),輔酶因子(金屬鐵離子、黃素和磷酸吡哆醛)在催化反應(yīng)中所起的不同作用,催化反應(yīng)的詳細(xì)機(jī)理以及反應(yīng)過(guò)程中過(guò)渡態(tài)和中間體的構(gòu)型和相關(guān)能量學(xué)信息,反應(yīng)過(guò)程中的電子轉(zhuǎn)移及關(guān)鍵殘基的重要作用等。通過(guò)對(duì)這些問(wèn)題的深入研究,在原子水平上闡明了這些蛋白酶催化過(guò)程的微觀機(jī)制,尤其是論文研究中涉及的幾種蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu)均為近幾年獲得,酶活性中心含有價(jià)態(tài)和自旋變化復(fù)雜的金屬鐵離子或者結(jié)構(gòu)易變的新型有機(jī)小分子輔因子,它們的催化過(guò)程比一般蛋白酶的催化過(guò)程更為復(fù)雜。本論文研究不僅揭示了這幾種蛋白酶的催化機(jī)制,還可為類(lèi)似酶的研究、仿生催化劑的設(shè)計(jì)、酶工程及酶的應(yīng)用提供重要的參考,具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用前景。論文研究工作主要包括以下幾個(gè)方面:(1)糞卟啉Ⅲ氧化脫羧酶HemQ催化機(jī)理研究糞卟啉Ⅲ氧化脫羧酶(HemQ)是一類(lèi)過(guò)氧化氫依賴(lài)酶,在血紅素的生物合成過(guò)程中,HemQ在過(guò)氧化氫的氧化作用下催化卟啉環(huán)上的兩個(gè)丙酸側(cè)鏈發(fā)生連續(xù)脫羧反應(yīng)生成血紅素。2017年,實(shí)驗(yàn)工作者表征了 HemQ的晶體結(jié)構(gòu),并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果建議了大致的反應(yīng)機(jī)理,但詳細(xì)的催化機(jī)理尚不明確。另外,實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)殘基Tyr144對(duì)兩個(gè)丙酸側(cè)鏈P2和P4的脫羧都至關(guān)重要,但在HemQ的晶體結(jié)構(gòu)中,P4丙酸側(cè)鏈距離Tyr144較遠(yuǎn),殘基Tyr144在脫羧過(guò)程的作用也不清楚。本論文采用QM/MM方法對(duì)HemQ催化coproheme III連續(xù)脫羧反應(yīng)的機(jī)理進(jìn)行了研究。計(jì)算結(jié)果闡明了催化反應(yīng)機(jī)理:P2首先抽取殘基Tyr144上的質(zhì)子并通過(guò)質(zhì)子耦合電子轉(zhuǎn)移過(guò)程引發(fā)催化反應(yīng);然后Tyrl44自由基奪取P2上Cβ的氫原子形成Cβ自由基;最后底物發(fā)生分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移導(dǎo)致丙烯側(cè)鏈的脫羧。其中Cβ-H鍵的裂解是整個(gè)催化反應(yīng)的決速步驟。另外,根據(jù)QIM/MM計(jì)算結(jié)果我們建議了其它可能的催化反應(yīng)路徑,在該路徑中殘基Val199和Tyrl44共同作為氫原子傳遞通道。P2脫羧完成之后,我們對(duì)丙酸側(cè)鏈P4的脫羧機(jī)理進(jìn)行了研究,并且發(fā)現(xiàn)殘基Lys148介導(dǎo)的P4脫羧反應(yīng)非常困難。對(duì)接結(jié)果表明,形成的中間體harderoheme Ⅲ需要調(diào)整結(jié)合模式,即先從活性區(qū)域離去然后再重新以一種新的結(jié)合模式進(jìn)入活性位點(diǎn),丙酸側(cè)鏈P4占據(jù)P2的位置,殘基Tyrl44繼續(xù)催化P4的脫羧反應(yīng)。計(jì)算結(jié)果揭示了底物與酶的結(jié)合模式,明確了 HemQ的催化反應(yīng)機(jī)理,為進(jìn)一步理解糞卟啉Ⅲ氧化脫羧酶以及血紅素的生物合成提供了理論指導(dǎo)。(2)阿魏酸脫羧酶FDC催化機(jī)理研究泛醌在有氧細(xì)胞呼吸系統(tǒng)電子傳遞鏈中起關(guān)鍵作用,而阿魏酸脫羧酶(FDC)參與泛醌前體的生物合成。研究者在大腸桿菌中同時(shí)表達(dá)了基因fdcl和ubix,得到了阿魏酸脫羧酶的晶體結(jié)構(gòu),其中輔酶因子呈兩種形式,分別為亞胺類(lèi)輔酶因子和酮亞胺類(lèi)輔酶因子(prFMNiminium和prFMNketimine),作者首次提出了阿魏酸脫羧酶的1,3-偶極環(huán)加成的催化反應(yīng)機(jī)理,但是詳細(xì)的催化過(guò)程尚不明確。基于阿魏酸脫羧酶的晶體結(jié)構(gòu),我們使用QM/MM方法對(duì)其脫羧反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行了研究。通過(guò)對(duì)兩類(lèi)輔酶因子(prFMNiminium和prFMNketimine)的催化活性進(jìn)行對(duì)比,驗(yàn)證了亞胺類(lèi)輔酶因子具有催化活性,而酮亞胺類(lèi)輔酶因子不具有催化活性。計(jì)算結(jié)果闡明了 FDC在輔酶因子prFMNiminium作用下的反應(yīng)機(jī)理:底物和輔酶因子首先通過(guò)1,3-偶極環(huán)加成生成吡咯烷中間體;然后羧酸基團(tuán)離去生成CO2;殘基Glu282作為質(zhì)子供體通過(guò)一分子水橋?qū)α質(zhì)子化,再次生成吡咯烷中間體;最后五元環(huán)中間體通過(guò)1,3-偶極環(huán)消除反應(yīng)生成苯乙烯產(chǎn)物。通過(guò)對(duì)反應(yīng)勢(shì)能剖面的分析發(fā)現(xiàn),Cα質(zhì)子化過(guò)程為整個(gè)反應(yīng)的決速步,能壘為23.5 kcal/mol。另外,我們還研究了 CO2的離去對(duì)反應(yīng)的影響,結(jié)果表明,推遲CO2的離去有利于Cα的質(zhì)子化進(jìn)程。酶活性中心的Mrn2+離子能夠通過(guò)配位鍵使底物準(zhǔn)確結(jié)合進(jìn)酶的活性中心。我們的計(jì)算結(jié)果為進(jìn)一步理解阿魏酸脫羧酶提供了理論基礎(chǔ),對(duì)泛醌生物合成的研究具有指導(dǎo)意義。(3)麥角硫因合成酶EgtB催化亞砜形成的機(jī)理研究麥角硫因是一類(lèi)天然抗氧化劑,它具有清除自由基、解毒、維持DNA的生物合成、維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)及細(xì)胞免疫等多種生理功能。麥角硫因的生物合成是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。麥角硫因合成酶(EgtB)是一類(lèi)獨(dú)特的非血紅素含鐵酶,它專(zhuān)一性的將底物γ-谷�；腚装彼�(γGC)和N-α-三甲基組氨酸(TMH)催化生成亞砜。研究者表征了 EgtB的晶體結(jié)構(gòu),建議了 EgtB的催化反應(yīng)機(jī)理。但是底物N-α-三甲基組氨酸的砜化過(guò)程和C-S鍵的形成過(guò)程的先后順序是一個(gè)存在爭(zhēng)議的問(wèn)題,具體的反應(yīng)細(xì)節(jié)也不明確。我們采用QM/MM方法對(duì)EgtB的催化反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行了研究,結(jié)果表明氧氣分子與鐵中心的配位模式有兩種(“end-on”模式和“side-on”模式),但是只有“end-on”模式具有反應(yīng)活性。對(duì)于初始反應(yīng)物,底物-Fe(Ⅱ)-O2復(fù)合物的電子結(jié)構(gòu)可描述為yGC-Fe(Ⅲ)-O2·-和γGC·-Fe(Ⅱ)-O2·-的雜化,開(kāi)殼層單重態(tài)為反應(yīng)物基態(tài),但是五重態(tài)對(duì)應(yīng)的反應(yīng)能壘較低。由于底物γGC和Fe(Ⅱ)-O2復(fù)合物之間的電子轉(zhuǎn)移導(dǎo)致γGC的S原子帶有自由基特性,有利于Fe(Ⅱ)-O2對(duì)S原子的進(jìn)攻。通過(guò)計(jì)算揭示了反應(yīng)的詳細(xì)機(jī)制,Fe(Ⅱ)-O2復(fù)合物首先與γGC形成四元環(huán)氧化物Fe-O-O-S,然后底物γGC的砜化過(guò)程伴隨著環(huán)氧化物Fe-O-O-S的開(kāi)環(huán),對(duì)應(yīng)的能壘為6.0 kcal/mol;接下來(lái),FeⅣ=O復(fù)合物抽取TMH的C2上的質(zhì)子,形成C2負(fù)離子。C2負(fù)離子的形成過(guò)程為整個(gè)反應(yīng)的決速步,能壘為21.7 kcal/mol。一旦形成C2負(fù)離子,便很容易生成產(chǎn)物2-組氨酸-半胱氨酸亞砜。計(jì)算表明,砜化過(guò)程發(fā)生在C-S成鍵過(guò)程之前。另外,我們對(duì)殘基Tyr377在反應(yīng)過(guò)程中的作用進(jìn)行了探討。FeⅣ=O復(fù)合物從Tyr377上抽取質(zhì)子非常容易,但是,形成的酚氧負(fù)離子并不能順利抽取TMH的咪唑環(huán)上的質(zhì)子。我們的研究結(jié)果有助于進(jìn)一步理解麥角硫因的生物合成以及相關(guān)酶的催化機(jī)制。(4)PLP依賴(lài)酶Egt2催化亞砜裂解的理論研究麥角硫因合成酶Egt2是一類(lèi)PLP依賴(lài)酶,主要催化麥角硫因生物合成過(guò)程中最后一步亞砜的C-S鍵裂解反應(yīng),是麥角硫因生物合成路徑中必需的一種酶。雖然實(shí)驗(yàn)上已經(jīng)對(duì)C-S鍵裂解酶的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了大量的研究,但對(duì)于Egt2的催化反應(yīng)機(jī)理尚不清晰。2018年,研究者在大腸桿菌中表征了 Egt2的晶體結(jié)構(gòu)并且發(fā)現(xiàn)活性區(qū)域位于兩個(gè)亞基的界面處,輔酶因子PLP和殘基Tyr134之間存在π-π堆積效應(yīng),但是殘基Tyr134的具體作用尚不明確�；贓gt2的晶體結(jié)構(gòu),我們采用QM/MM方法對(duì)亞砜裂解酶Egt2的催化反應(yīng)進(jìn)行了深入研究,給出了最可能的反應(yīng)路徑,反應(yīng)由四個(gè)基元反應(yīng)組成:Cα去飽和化反應(yīng)、亞砜裂解反應(yīng)、賴(lài)氨酸加成反應(yīng)以及氨基丙烯酸的形成反應(yīng)。在氨基丙烯酸的形成過(guò)程中,殘基Lys247與PLP-氨基丙烯酸的C1=N1雙鍵發(fā)生加成反應(yīng),然后發(fā)生分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移過(guò)程。分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移過(guò)程為整個(gè)催化循環(huán)的決速步,能壘為22.5 kcal/mol。探討了保守殘基的作用,去質(zhì)子化的Tyr134殘基可以作為催化酸堿來(lái)奪取Cα位置的質(zhì)子,之后介導(dǎo)亞砜基團(tuán)的裂解。通過(guò)理論計(jì)算揭示了輔酶因子PLP在Egt2酶中的催化反應(yīng)本質(zhì),修正了先前實(shí)驗(yàn)上建議的Egt2的催化機(jī)理,這些計(jì)算結(jié)果為麥角硫因生物合成路徑的機(jī)理研究提供了新的視角和啟示。本論文特色和創(chuàng)新之處(1)從理論上闡述了糞卟啉Ⅲ氧化脫羧酶的催化機(jī)理,揭示了殘基Tyr144和丙酸側(cè)鏈之間的質(zhì)子耦合電子轉(zhuǎn)移過(guò)程是啟動(dòng)氧化脫羧反應(yīng)的關(guān)鍵,證實(shí)了 P2脫羧后的中間體需要重新結(jié)合到活性中心才能發(fā)生P4的脫羧。(2)闡明了阿魏酸脫羧酶的1,3-偶極環(huán)加成的脫羧機(jī)理,通過(guò)對(duì)輔酶因子prFMNiminium和prFMNketimine的對(duì)比研究揭示了亞胺類(lèi)輔酶因子prFMNiminium具有催化活性的本質(zhì)。(3)明確了麥角硫因合成酶EgtB中底物、鐵中心和氧氣之間的結(jié)合模式以及電子傳遞過(guò)程,證明了催化反應(yīng)中Fe-O-O-S中間體的形成是催化反應(yīng)的必需步驟,確定了亞砜形成過(guò)程和C-S成鍵過(guò)程的先后順序以及具體的反應(yīng)細(xì)節(jié),解決了機(jī)理研究上存在的爭(zhēng)議。(4)確定了麥角硫因合成過(guò)程中的亞砜裂解酶Egt2的催化反應(yīng)機(jī)制,修正了前期實(shí)驗(yàn)上建議的反應(yīng)機(jī)理,給出了催化反應(yīng)的最可能路徑;揭示了輔酶因子PLP以及殘基Tyr134在催化中的關(guān)鍵作用。
【圖文】：

物的情況下就需要借助對(duì)接手段來(lái)獲取合理的酶－底物復(fù)合物，例如，將Ｌ－賴(lài)氨酸逡逑分子對(duì)接到甲基鳥(niǎo)氨酸合成酶中，來(lái)研究甲基鳥(niǎo)氨酸合成酶結(jié)合賴(lài)氨酸的反應(yīng)［２）逡逑（圖２－１）。目前比較常用的對(duì)接軟件有ＳＬＩＤＥ［３］、ＤＯＣＫｗ、ＡｕｔｏＤｏｃｋ［５＾，本論逡逑文采用半柔性對(duì)接，使用的是ＡｕｔｏＤｏｃｋ軟件。ＡｕｔｏＤｏｃｋ里采用格點(diǎn)對(duì)接方法，模逡逑擬淬火和拉馬克遺傳算法來(lái)搜尋生物大分子和配體小分子的最佳結(jié)合方式，使用半逡逑經(jīng)驗(yàn)的自由能打分函數(shù)計(jì)算方法來(lái)獲取二者之間的識(shí)別匹配情況。逡逑２．２分子力學(xué)和分子動(dòng)力學(xué)方法逡逑分子力學(xué)（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｍｅｃｈａｎｉｃｓ）和分子動(dòng)力學(xué)方法（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｄｙｎａｍｉｃｓ，邋ＭＤ）逡逑都是采用分子力場(chǎng)參數(shù)通過(guò)積分算法求解Ｎｅｗｔｏｎ運(yùn)動(dòng)方程的過(guò)程。分子力學(xué)和分逡逑子動(dòng)力學(xué)模擬的區(qū)別在于前者是經(jīng)驗(yàn)力場(chǎng)模型，以原子為質(zhì)點(diǎn)，服從經(jīng)典力學(xué)運(yùn)動(dòng)逡逑規(guī)律；而分子動(dòng)力學(xué)求解的是隨時(shí)間變化的分子的狀態(tài)、行為和過(guò)程。逡逑２．２．１分子力學(xué)方法逡逑分子力學(xué)是以給定的分子模型為基礎(chǔ)，，對(duì)給出的分子試探結(jié)構(gòu)采用經(jīng)驗(yàn)勢(shì)函數(shù)逡逑表征結(jié)構(gòu)單元之間的相互作用，從試探構(gòu)象附近篩選出能量極值點(diǎn)和相應(yīng)的結(jié)構(gòu)。逡逑１８逡逑

大分子體系的研究中，ＱＭ部分主要包括底物小分子、輔酶因子、部分水分子以及逡逑活性區(qū)域內(nèi)的部分殘基；而其余的蛋白質(zhì)部分以及周?chē)娜軇┓肿觿t為ＭＭ區(qū)（如逡逑圖２－２所示）。ＱＭ／ＭＭ方法一定程度上結(jié)合了邋ＱＭ方法的準(zhǔn)確性（用來(lái)描述化學(xué)逡逑鍵的變化以及電子轉(zhuǎn)移情況）和ＭＭ方法的計(jì)算速度（用來(lái)描述蛋白質(zhì)環(huán)境對(duì)反應(yīng)逡逑的影響）。體系的總能量不能簡(jiǎn)單地描寫(xiě)為ＱＭ區(qū)和ＭＭ區(qū)的能量總和，需要考慮逡逑ＱＭ區(qū)和ＭＭ區(qū)之間相互作用的耦合項(xiàng)￡■＿＿＿。針對(duì)區(qū)域間相互作用的處理辦法逡逑—共有兩種方案：減法方案（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ邋ｓｃｈｅｍｅ）和加法方案（ａｄｄｉｔｉｖｅ邋ｓｃｈｅｍｅ）。逡逑減法方案中體系的總能量被描述為：逡逑＝邋ＥｑＪＱＭ）邋＋邋Ｅ，ｍ（Ｓ）邋－邋Ｅｍ（ＱＭ）邐（２．３）逡逑其中＾

本文編號(hào)：2569795