【摘要】：本文所選用的蕪菁(Brassica rapa L.)和瑪咖(Lepidium meyenii Walp.)植物材料均來自西藏地區(qū)�，斂ё畛跤�2003年從南美秘魯引進至中國云南,并于2010年前后引種至西藏地區(qū),而西藏蕪菁(俗稱芫根)則是青藏高原地區(qū)傳統(tǒng)的藥、食、飼三用作物,具有悠久的種植歷史。目前,國內(nèi)外關(guān)于瑪咖生物學(xué)功能的研究較多,主要集中在提高性功能、促進生育能力、抗疲勞等方面,而對西藏蕪菁的研究相對較少。多糖是這兩種高原作物次生代謝產(chǎn)物的重要組成部分,目前被認為是其發(fā)揮生物學(xué)功效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一。本文采用傳統(tǒng)的水提醇沉法從蕪菁和瑪咖塊莖中獲得粗多糖,進一步分離純化得到蕪菁多糖和瑪咖多糖樣品。采用高分辨凝膠滲透色譜(HPGPC)、掃描電鏡(SEM)和原子力顯微鏡(AFM)等技術(shù)手段對兩種多糖的物理特性進行比較研究;采用糖基組成分析、甲基化分析、紅外光譜、氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)和核磁共振(NMR)等手段對其化學(xué)結(jié)構(gòu)進行比較研究。同時,采用小鼠負重游泳試驗?zāi)Ｐ驮u價和比較其抗疲勞生物學(xué)功效。此外,構(gòu)建H2O2誘導(dǎo)的PC12細胞體外抗氧化評價模型,比較兩者的抗氧化能力;并采用蛋白免疫印跡和細胞免疫熒光技術(shù),考察其對特異蛋白Bax和Bcl-2表達水平的影響。主要研究內(nèi)容與結(jié)果如下:(1)采用常規(guī)技術(shù)、在相同條件下獲得精制的蕪菁多糖和瑪咖多糖,試樣純度分別為94.61%和99.20%(以試樣干基計),得率分別為0.94%和1.06%(以原料干基計)。蕪菁多糖的重均分子量(Mw)為193.18 kDa,瑪咖多糖的Mw為 793.5 kDa。(2)糖基組成分析結(jié)果表明,蕪菁多糖和瑪咖多糖均為富含半乳糖醛酸(D-GalA)的酸性多糖。蕪菁多糖中檢出7種糖基,其摩爾百分比(moL,%)為,半乳糖醛酸(D-GalA):甘露糖(D-Man):阿拉伯糖(L-Ara):半乳糖(D-Gal):葡萄糖(D-Glc):鼠李糖(L-Rha):葡萄糖醛酸(D-GlcA)=67.73:17.19:10.20:3.19:1.11:0.34:0.23;瑪咖多糖中檢出6種糖基,其摩爾百分比(moL,%)為,D-GalA:D-Glc:L-Ara:D-Man:D-Gal:L-Rha= 35.07:29.98:16.98:13.01:4.21:0.75。蕪菁多糖中D-GalA含量(67.73%)幾乎是瑪咖多糖(35.07%)的兩倍,但D-Glc含量很低(1.11%);而瑪咖多糖中D-Glc含量高達29.98%,但未檢出D-GlcA。甲基化分析、GC-MS以及NMR等研究結(jié)果表明,蕪菁多糖主要通過β-1,3,6-GalpA和β-1,3-Galp(A)通過1,3糖苷鍵連接形成化學(xué)骨架,而瑪咖多糖則主要通過β-1,3-Galp/GalpA、β-1,3-Glcp和α-1,3-Manp通過1,3糖苷鍵連接形成化學(xué)骨架。(3)蕪菁多糖與瑪咖多糖在所試劑量范圍內(nèi)均表現(xiàn)出良好的抗疲勞活性。小鼠負重游泳試驗數(shù)據(jù)顯示,與正常組(前5 min平均游泳速率為10.31 ±4.54 cm/s,游泳總時長為46.56±29.67min)相比,蕪菁多糖中劑量(50mg/kg.bw/d)效果不顯著(p0.05),高劑量(100 mg/kg.bw/d)能顯著提高平均游泳速率(15.15±3.25cm/s,p0.05),并顯著延長游泳總時長(106.10±42.00min,p0.05)。瑪咖多糖的抗疲勞活性強于蕪菁多糖,中劑量即表現(xiàn)出顯著效果(p0.05),高劑量極顯著地提高了平均游泳速率(17.21±5.21 cm/s,p0.01)和游泳總時長(171.67±69.68 min,p0.01)。小鼠血生化分析結(jié)果表明,與正常組小鼠相比,蕪菁多糖高劑量能顯著提高GSH-Px活力(p0.05);瑪咖多糖中、高劑量組能顯著(p0.05)和極顯著(p0.01)地提高GSH-Px活力。而兩種多糖對SOD酶活力的影響未表現(xiàn)出統(tǒng)計學(xué)上的差異(p0.05)。蕪菁多糖和瑪咖多糖均具有降低小鼠血清乳酸脫氫酶(LDH)活力的作用,與正常組相比,蕪菁多糖高劑量極顯著地降低了小鼠血清LDH活力(p0.01);瑪咖多糖中劑量顯著降低LDH活力(p0.05),高劑量極顯著降低LDH活力(p0.01)。此外,兩種多糖均能顯著降低小鼠血清中乳酸(LA)、尿素氮(BUN)和丙二醛(MDA)等代謝廢物的水平,其中,蕪菁多糖表現(xiàn)出優(yōu)于瑪咖多糖的降LA效果,但降BUN的效果不如瑪咖多糖,降MDA的作用相近。對能量物質(zhì)的影響,與正常組相比,各給藥組小鼠的肌糖原含量差異不明顯,肝糖原含量隨著多糖劑量增大呈下降趨勢(p0.05)。(4)在H_2O_2誘導(dǎo)的PC12氧化損傷細胞模型中,高濃度(10～80 μg/mL)的蕪菁多糖和瑪咖多糖對細胞均表現(xiàn)明顯的增殖抑制作用,而低濃度(0.001～1.0μg/mL)時則表現(xiàn)出一定的保護作用。在相同濃度范圍(0.001～1.0 μg/mL)內(nèi),瑪咖多糖對PC12細胞的保護作用強于蕪菁多糖。在此體外評價的細胞模型中,還觀察到兩種多糖均可上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。綜上研究表明,蕪菁多糖和瑪咖多糖在糖基組成和化學(xué)骨架上存在一定差異,均在整體動物試驗中表現(xiàn)出良好的抗疲勞作用,并在細胞試驗中表現(xiàn)出良好的抗氧化生物活性。總體而言,瑪咖多糖的抗疲勞功效略優(yōu)于蕪菁多糖。
【圖文】：

原子力顯微鏡是一種精度能夠達到原子級別的表面結(jié)構(gòu)分析手段ｆｉＭｉ。借助逡逑原子為顯微鏡可レNB非常直觀地反應(yīng)《糖樣本巧化部特征。電子掃描顯微鏡觀察到逡逑的憲菁多糖外部結(jié)構(gòu)為泡膜狀，表面多孔疏松（圖２－２Ａ）。同時，原子力顯微逡逑鏡表明憲菁多糖的分子鏈長較小，在對應(yīng)的３Ｄ結(jié)構(gòu)困中表現(xiàn)為若干不規(guī)則的西逡逑起，最高的田起不崣過９．５邋ｎｍ邋（圖２－３Ａ２）。而瑪咖多糖的化形成簇狀，表面光逡逑潔，在空間上形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（圖２－２Ｂ），可能與其含有３１４０ｋＤａ的超大分子量逡逑多糖有關(guān)。這一點在原子力顯微鏡中也得到了驗證，瑪姍■多糖在原子為顯微圖中逡逑的光亮點即為大分子量的瑪伽多糖（圖２－３Ｂ１），對應(yīng)的３Ｄ結(jié)構(gòu)圖中則表現(xiàn)為逡逑若干不規(guī)則的山峰狀凸起，其最大高度可達７２ｎｍ。表明相同制備條件和手段下逡逑獲得的瑪如多糖具有顯著大于憲菁多糖的分子鏈長。逡逑２９逡逑

３．２．１憲菁多糖和瑪咖多糖的紅外光譜逡逑采用紅外光譜對憲菁多糖和瑪伽＃糖的送基、緩基等主要化學(xué)基團進行初步逡逑分析。圖３－１Ａ和圖３－１Ｂ是多糖甲基化之前的紅外圖譜，兩種多糖的紅外圖譜整逡逑體上具有高度的相化性，并具有多楚基踏糖的典型特征。對比文獻的數(shù)據(jù)，３３８４逡逑ｃｍｆｉ邋（３４０４邋ｃｍ－ｉ）處的信號代表了憲菁多糖（瑪吻１多糖）的愛基伸縮振動吸收峰；逡逑２９３４邋ｃｍ－ｉ邋（２９３１邋ｃｍ－ｉ）處較弱的肩峰代表了憲菁多糖（瑪伽多糖）的Ｃ－Ｈ伸縮逡逑與彎曲振動；１０７４邋ｃｍ—ｉ邋（１０７８邋ｃｍ－ｉ）處的強吸收代表了憲菁多糖（巧＃多糖）逡逑Ｃ－０的伸縮振動，同時兩者在１６３４？１７３８邋ｃｍ＾ｉ處有Ｃ＝０非對稱伸縮振動，這表逡逑明它們都具有較高的糖醒酸含量。逡逑Ａ邐Ｒ逡逑Ｍｆｍ邐２（ｍ邐＊卿邐y睈T邐２邋s6邐ｌｅｅｅ逡逑Ｗａｖｅｎａｍｂｅｒｓ邋（ｃ腳Ｉ）邐Ｗａｖｅｎｕｍｂｅｒｓ邋腳ａ邋）逡逑圖３－１憲菁多糖（Ａ）和瑪＃多糖（Ｂ）甲基化前（下）后（上）的紅外吸收光譜逡逑Ｆｉｇ．邋３－１邋ＦＩＴ民邋ｓｐｅｃ化ａ邋ｏｆ邋ＴＰ邋（Ａ）邋ａｎｄ邋ＭＰ邋（Ｂ）邋ｂｅｆｏｒｅ邋（ｂｅｌｏｗ）邋ａｎｄ邋ａｆｔｅｒ邋（ａｂｏｖｅ）邋ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ逡逑３．２．２憲菁多糖和瑪伽多糖的糖基組成分析逡逑在前期預(yù)實驗過程中，，采用１１種單糖標準品進行多糖的糖基組成分析。分逡逑別在憲菁多糖和瑪咖多糖中檢出７種和６種糖基。隨后Ｗ鼠李糖（ＬＲｈａ）、阿逡逑拉伯糖ａ－Ａｒａ）和葡萄糖（Ｄ－Ｇｌｃ）等７種單糖作為對照肌醇為內(nèi)標），憲逡逑菁多糖和巧如多糖試樣經(jīng)ＴＦＡ水解、s晟棧把萇笥茫牽茫停蛹觳馓腔槌

本文編號：2567095