【摘要】：聚合納米藥物/基因載體在體內(nèi)傳輸過程中,必須克服重重生理障礙來實現(xiàn)最終的治療效果。對于系統(tǒng)給藥的體內(nèi)遞送過程,從納米載體注入血液中開始,相繼通過血液循環(huán),腫瘤富集,組織滲透,細胞內(nèi)化,藥物釋放,并最終作用于靶點等多個關鍵性步驟。在不同階段,納米載體在體內(nèi)環(huán)境中會遭遇到不同的生理屏障,克服這些不同的生物屏障對納米載體特征提出了不同的要求。在過去幾十年中,聚合物納米載體從性能單一的體系逐漸向動態(tài)、智能方向轉(zhuǎn)變,從而增強最終的治療效果。然而,由于體內(nèi)生理障礙的復雜性,以及腫瘤微環(huán)境異質(zhì)性,需要探索更加有效的載體設計策略。因此,本論文主要圍繞聚合物納米載體在體內(nèi)輸送過程中的障礙,利用并發(fā)展主動調(diào)節(jié)和分級靶向策略,來實現(xiàn)聚合物納米載體的高效體內(nèi)傳輸�；诖怂悸�,論文可以進一步分為以下五個主要部分:一、多殼層非病毒PEG化聚陽離子基因載體的構筑。安全有效的基因遞送載體設計是實現(xiàn)基因治療的關鍵。傳統(tǒng)的非病毒基因載體由于體內(nèi)核酸酶和其他生物分子(如硫酸乙酰肝素)的存在在血液循環(huán)中很不穩(wěn)定,這導致全身基因遞送的效率特別低下。在這里,利用疏水作用來穩(wěn)定和保護基于聚陽離子嵌段聚合物的基因載體,構建了一個多殼層的非病毒基因載體。通過在室溫下首先將質(zhì)粒pDNA與PEG-b-PAsp(DET)和PNIPAM-b-PAsp(DET)的混合嵌段共聚物之間靜電絡合(PEG為聚乙二醇,PNIPAM為聚異丙基丙烯酰胺;PAsp(DET)為側鏈二亞乙基三胺修飾的聚天冬氨酸,可以被用作DNA絡合的生物相容可降解的高效DNA傳輸載體),然后在體溫下形成最終多殼層聚離子復合物膠束。由于PNIPAM的溫敏效應,體溫下會坍縮,在PEG外殼層和pDNA核之間形成疏水中間層。這種多層的結構顯示出更緊密的pDNA絡合能力,增強了對核酸酶攻擊和聚陰離子交換的耐受性,導致了更長的血液循環(huán)和腫瘤富集效果以及在腫瘤組織的高效基因轉(zhuǎn)染,負載治療基因sFlt-1 pDNA的復合膠束也顯示了較好的抗腫瘤效果。二、去PEG化分級靶向納米載體的構筑。盡管聚乙二醇化納米載體可以在血液循環(huán)中達到較好地"隱身"效果而被認為是很有希望的遞送載體,但是PEG化將阻礙它們與細胞的結合,降低細胞攝取和內(nèi)涵體逃逸的效率。為了解決PEG化納米載體的兩難困境,我們發(fā)展了基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)響應性去PEG化的的智能基因(PEG-GPLGVRG-PAsp(DET))和阿霉素藥物遞送載體(PEG-GPLGVRGDG-P(BLA-co-Asp))(GPLGVRG 和 GPLGVRGDG 為 MMP 可響應性裂解短肽;PEG為聚乙二醇,PAsp(DET)為側鏈二亞乙基三胺修飾的聚天冬氨酸,P(BLA-co-Asp)為部分水解的聚芐基天冬氨酸),在MMP作用下,可暴露出正電荷的核層或靶向細胞的RGD配體。研究結果表明,可去PEG化納米載體表現(xiàn)出更強的細胞內(nèi)化和內(nèi)涵體逃逸,最終達到了高效的基因轉(zhuǎn)染或更大的細胞毒性。進一步地,構建了一種由三嵌段共聚物PEG-GPLGVRG-b-PCL-b-PGPMA(PCL為聚己內(nèi)酯,PGPMA嵌段是一種模擬細胞穿透肽CPP的側鏈胍基取代聚合物)自組裝得到的MMP響應性不對稱囊泡。大部分PGPMA(大約90%)分布在囊泡不對稱結構的內(nèi)層,可以更加高效的偽裝PGPMA的功能。在MMP-2存在下,囊泡去PEG化,導致結構重排,PGPMA翻轉(zhuǎn)暴露到載體表面(大約75%)。因此,所提出的囊泡系統(tǒng)可以用作一種遞送藥物的動態(tài)組裝體,可以特異性在MMP高表達的組織中,促進對包封藥物的攝取。當使用這種囊泡分別將親水性MMP抑制劑和疏水性抗癌藥物秋水仙素包封在囊泡內(nèi)腔和疏水膜內(nèi),可以同時實現(xiàn)負反饋調(diào)節(jié)機制的MMP抑制劑釋放和增強的細胞內(nèi)化。MMP酶的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和細胞內(nèi)抗癌藥物的高效遞送最終實現(xiàn)對高轉(zhuǎn)移性4T1乳腺癌生長和轉(zhuǎn)移的抑制。三、多級遞送體系的構筑。前面兩章節(jié)旨在解決聚合物納米載體血液循環(huán)、腫瘤富集和細胞內(nèi)化的障礙,然而在腫瘤實質(zhì)和間質(zhì)里,納米載體還面臨一個很重要的問題:組織滲透,這已經(jīng)成為很多納米載體在腫瘤組織層面具有抗藥性的原因。為了克服聚合物納米載體的多重生物屏障,同時實現(xiàn)藥物的深層次腫瘤滲透和高效細胞內(nèi)化等,通過陰離子嵌段共聚物PEG-bb-PAsp(EDA-DM)(PEG為聚乙二醇,PAsp(EDA-DM)為側鏈二甲基馬來酸酐修飾的聚天冬氨酸)和陽離子樹枝狀大分子聚酰胺-胺順鉑前藥(PAMAM-Pt(Ⅳ))之間的靜電絡合制備了一種多級藥物遞送系統(tǒng)。由于PAsp(EDA-DM)的酸響應電荷反轉(zhuǎn)特性,靜電復合物膠束在pH 6.8下可以釋放出二級載體PAMAM-Pt(Ⅳ)。結果證明釋放的小尺寸PAMAM-Pt(Ⅳ)顯示出高效的腫瘤組織滲透和細胞內(nèi)化能力,隨后在細胞內(nèi)還原環(huán)境中釋放活性抗癌藥物順鉑。然而,僅僅依靠靜電絡合作用難以保證聚離子復合物膠束在體內(nèi)環(huán)境中能夠保持較高的穩(wěn)定性。因此,進一步在聚合物中引入了疏水鏈段聚己內(nèi)酯(PCL)以形成三嵌段共聚物PEG-b-PAsp(EDA-DM)-b-PCL。體內(nèi)研究表明,因為疏水作用的存在,通過PEG-b-PAsp(EDA-DM)-b-PCL膠束和PAMAM-Pt(Ⅳ)形成的靜電復合載體,可以實現(xiàn)長時間血液循環(huán),通過EPR效應實現(xiàn)腫瘤富集,最終在腫瘤組織微酸性環(huán)境下,逐步釋放小尺寸正電荷的二級載體,達到深層次組織滲透和高效細胞內(nèi)化。另一方面,光敏劑納米載體在腫瘤治療中同樣面臨組織滲透和細胞內(nèi)化問題,此外,腫瘤乏氧環(huán)境也嚴重影響光動力療法(PDT)的效率。為了解決這些PDT的生物屏障,將過氧化氫(H_2O_2)和樹枝狀大分子光敏劑/光熱劑(CC-PAMAM)負載到活性氧(ROS)響應性聚合物囊泡空腔中構建多級遞送載體。在805 nm和660 nm激光作用下,光熱效應將熱不穩(wěn)定的H_2O_2分解成02,緩解了腫瘤乏氧環(huán)境;PDT中產(chǎn)生的單線態(tài)氧使囊泡載體解體,從而釋放出光活性的CC-PAMAM,在滲透性很差的高度乏氧的BxPC-3腫瘤中實現(xiàn)深層次滲透,達到光敏劑的均勻分布�；诠饷魟┑母咝B透和乏氧環(huán)境的改善,BxPC-3腫瘤可以被PDT完全消融。四、自滿足式過氧化氫響應性多功能納米載體的構筑。與正常組織相比,腫瘤組織具有明顯不同的微環(huán)境特征,為聚合物的內(nèi)源性刺激響應提供了可能,如前面章節(jié)發(fā)展的MMP和酸響應性聚合物。然而,正常組織和腫瘤組織微環(huán)境之間的特征環(huán)境往往差異很小,而且腫瘤微環(huán)境具有很大的異質(zhì)性,這就妨礙了刺激響應性聚合物納米載體或前藥的體內(nèi)應用。本章提出了一種主動上調(diào)腫瘤組織微環(huán)境的策略,通過多功能聚合物納米載體擴大正常組織和腫瘤組織之間的信號差異,為前藥的高效釋放提供可能。將促氧劑PA(Vc衍生物)共同負載進H_2O_2響應性喜樹堿(CPT)聚合物前藥膠束PEG-b-PCPTOEMA(PEG為聚乙二醇,PCPTOEMA為CPT聚合物前藥),PA賦予了納米載體在腫瘤組織中自滿足式產(chǎn)生H_2O_2。H_2O_2的產(chǎn)生被證明特異性的發(fā)生在腫瘤部位,不僅提高了腫瘤的氧化應激壓力,誘導腫瘤細胞凋亡,而且還作為H_2O_2來源引發(fā)化療藥物CPT從聚前藥膠束中的釋放。系統(tǒng)給藥治療結果顯示這種納米載體可以通過協(xié)同氧化-化療實現(xiàn)對腫瘤生長的有效抑制。五、"自殺式"治療型納米反應器的構筑。在各種疾病的治療和診斷應用上,酶負載的納米反應器已經(jīng)引起了巨大的研究興趣。本章發(fā)展了具有放大腫瘤氧化療法能力的葡萄糖氧化酶(GOD)負載的治療型納米反應器(theraNR)。theraNR由pH和H_2O_2雙重響應性兩親性聚合物與GOD共組裝得到。theraNR可以成功地將GOD遞送到腫瘤部位并長期保留酶的活性。在腫瘤微酸和高糖環(huán)境中,可以選擇性地在腫瘤部位發(fā)生酶催化級聯(lián)反應以產(chǎn)生H_2O_2并同時刺激theraNR釋放醌甲基化合物(QM)。QM可以與谷胱甘肽(GSH)發(fā)生親核加成以消除GSH。最終H_2O_2和QM協(xié)同放大了腫瘤的氧化應激應力,實現(xiàn)了納米反應器介導的酶氧化療法。這種新型的治療型納米反應器同樣可以解決氧化環(huán)境響應性高分子在腫瘤微環(huán)境中響應程度和速度慢(如本章使用的基于苯硼酸酯的聚合物)和腫瘤微環(huán)境異質(zhì)性的問題;此外,這種治療型納米反應器可以進一步發(fā)展為高效的酶/前藥傳輸體系。
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【學位授予單位】：中國科學技術大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：TQ460.1
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本文編號：2460994