【摘要】：全氟及多氟烷基化合物(Per-and polyfluoroalkyl substances,PFASs),是新型持久性有機(jī)污染物的一種,以其生物毒性大、化學(xué)和熱穩(wěn)定性強(qiáng)、生物難降解、環(huán)境分布廣等特點(diǎn),且部分PFASs可通過生物蓄積和食物鏈在生物體內(nèi)不斷富集,并在人和動(dòng)物體內(nèi)廣泛檢出,所造成的危害己被廣泛關(guān)注。針對(duì)PFASs進(jìn)入機(jī)體后難以排出,通過誘導(dǎo)機(jī)體氧化造成機(jī)體毒性損傷。而迄今罕有緩解PFASs毒害的臨床藥物,其中膽汁酸螯合劑存在較大副作用,且安全性和有效性有待系統(tǒng)研究。較于螯合劑方法在中毒后的被動(dòng)治療,膳食策略可為PFASs危害前主動(dòng)地預(yù)防提供新解決途徑,但目前具有緩解PFASs毒性效果的膳食因子如抗氧化植物化合物等均需較大的攝入量才有效,而大量攝入帶來的風(fēng)險(xiǎn)也很難評(píng)估�？紤]到乳酸菌對(duì)黃曲霉毒素、重金屬等具有吸附作用,抗氧化性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),使其具備緩解PFASs危害的潛力,但尚未見乳酸菌緩解PFASs毒性的研究。鑒于此,本課題針對(duì)典型PFASs—全氟辛酸(Perfluorooctanoate,PFOA)和全氟辛烷磺酸(Perfluorooctane sulfonate,PFOS)的危害,發(fā)展快速、準(zhǔn)確篩選高抗氧化性乳酸菌的細(xì)胞抗氧化模型,并將有應(yīng)用潛力的乳酸菌通過動(dòng)物模型驗(yàn)證其功能并研究其作用機(jī)制。主要結(jié)果如下:首先發(fā)展細(xì)胞抗氧化方法(Cellular antioxidant activity,CAA)評(píng)價(jià)乳酸菌抗氧化活性,通過比較不同濃度(107、108和109 CFU/m L)下乳酸菌菌株的抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)109 CFU/m L乳酸菌菌株的CAA活性高于107和108 CFU/m L。并將CAA與4種常見的乳酸菌抗氧化活性評(píng)價(jià)方法:DPPH自由基清除活性、羥自由基清除活性、還原能力、抑制脂質(zhì)過氧化活性進(jìn)行比較,結(jié)果表明CAA與4種化學(xué)方法得到的結(jié)果是一致的。由于CAA是在細(xì)胞水平進(jìn)行的,比化學(xué)方法更接近體內(nèi),較適合篩選出體內(nèi)高抗氧化活性乳酸菌。進(jìn)一步建立了RAW264.7、Caco-2和EA.hy926細(xì)胞模型的CAA活性分析,結(jié)果表明3種細(xì)胞模型相關(guān)性較好,可用于乳酸菌抗氧化活性的分析。然后復(fù)篩得到耐受PFOA、PFOS的25株乳酸菌菌株,并分析菌株對(duì)PFOA、PFOS的吸附活性、耐酸耐膽鹽活性、細(xì)胞抗氧化活性以及粘附特性,最終篩選到L.plantarum CCFM738可在pH 3.0,6 h內(nèi)吸附初始濃度50 mg/L的PFOA 49.40%±1.5%,并有很高的細(xì)胞抗氧化活性(11.89±1.1μM Quercetin),具有潛在緩解PFOA毒性的可能。而L.plantarum CCFM737可在pH 7.0,6 h內(nèi)吸附初始濃度為50 mg/L的PFOS 60.00%±1.5%,并有很強(qiáng)的細(xì)胞抗氧化活性(9.87±0.98μM Quercetin),具有潛在緩解PFOS毒性的可能。進(jìn)一步研究了L.plantarum CCFM738對(duì)PFOA,L.plantarum CCFM737對(duì)PFOS的吸附特性,探究了時(shí)間、pH對(duì)菌株吸附PFOA、PFOS的影響。系統(tǒng)研究了PFOA、PFOS對(duì)C57BL/6J雄性小鼠的急性和亞慢性毒性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PFOA、PFOS對(duì)小鼠的半數(shù)致死劑量(LD50)分別為0.457 g/kg BW和0.579 g/kg BW。在PFOA的亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)中,小鼠連續(xù)30天灌胃0.075、0.15和0.3 g PFOA/kg BW,結(jié)果造模組與對(duì)照組相比,造模組PFOA小鼠的食物攝入量、體重、腎臟比和脾臟比明顯降低(p0.05),肝臟比明顯增加(p0.05)。病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)肝臟和腎臟有明顯的損害,而脾臟有輕微出血現(xiàn)象。PFOA造模組結(jié)果表明小鼠血液生化指標(biāo)、尿液相關(guān)指標(biāo)、氧化應(yīng)激參數(shù)以及組織病理學(xué)發(fā)生明顯改變。小鼠暴露于PFOS 30天(2.5、5和10 mg PFOS/kg BW/day),打亂了小鼠抗氧化代謝系統(tǒng),誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞凋亡,引起肝臟損傷,最終小鼠肝臟增大、重量增加,明確了PFOS對(duì)小鼠的肝臟毒性;與肝臟的明顯變化相比,腎臟的大小、腎臟損傷的標(biāo)記物,以及腎臟組織切片觀察均無明顯變化。建立飼喂L.plantarum CCFM738對(duì)急性PFOA暴露小鼠毒性的緩解效果。相比于急性PFOA暴露造模組小鼠,丙二醛(Malondialdehyde,MDA)活性降低、抗氧化酶活性增加、血清酶活降低、炎癥因子抑制、病理學(xué)改變減弱,都表明CCFM738可以緩解PFOA造成的肝臟損傷。分別設(shè)立預(yù)防組和治療組,發(fā)現(xiàn)治療組效果低于預(yù)防組,原因在于,治療組緩解腎臟損傷作用較弱,并改善小鼠氧化損傷較小,因此對(duì)于PFOA造成的急性損傷修復(fù)能力低于預(yù)防組。相比于急性PFOS造模組小鼠,飼喂CCFM737(1×109 CFU/天)能顯著降低小鼠的肝臟體重指數(shù),提高小鼠糞便PFOS含量、降低肝臟PFOS含量、恢復(fù)PFOS暴露導(dǎo)致的氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的變化,并減輕急性PFOS毒性導(dǎo)致的組織病理?yè)p傷。然而CCFM737干預(yù)的預(yù)防組和治療組對(duì)于尿液中PFOS含量無明顯改變,這也表明CCFM737緩解PFOS損傷的靶點(diǎn)在于肝臟,而對(duì)于腎臟的緩解作用較弱。通過研究PFOA對(duì)小鼠亞慢性毒性,闡明PFOA的毒性機(jī)制。一方面是升高的MDA活性引發(fā)脂質(zhì)過氧化,從而導(dǎo)致酰基輔酶A氧化酶(Palmitoyl CoA oxidase,ACOX)活性顯著增加,使得機(jī)體過氧化酶體增加,從而導(dǎo)致機(jī)體抗氧化酶活性降低,ROS產(chǎn)生,造成機(jī)體肝臟損傷。另一方面是通過過氧化物酶體增殖,從而造成小鼠脾臟的萎縮,小鼠免疫能力改變,血清細(xì)胞因子的改變。而且PFOA亞慢性預(yù)防組和治療組的造模癥狀是不同的,PFOA造模引起的預(yù)防組的腎臟比重和脾臟比重顯著高于治療組。而且在PFOA亞慢性毒性暴露中,預(yù)防組會(huì)造成小鼠肝臟、腎臟損傷,而治療組未能造成小鼠腎臟損傷。但相較于PFOA亞慢性造模組,乳酸菌CCFM738明顯的降低了MDA活性,降低了升高的ACOX活性,而且加上乳酸菌的的吸附作用,使得其明顯的改善了PFOA亞慢性暴露引起的肝臟損傷(升高的血清酶活)、腎臟損傷、以及脾臟萎縮引起的免疫損傷。PFOS亞慢性毒性與PFOA相似的是均可以通過升高M(jìn)DA活性,誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化,進(jìn)一步導(dǎo)致ACOX活性顯著提高,使得機(jī)體損傷,不同的是PFOS亞慢性毒性會(huì)上調(diào)MAPKs信號(hào)通路相關(guān)激酶表達(dá)量,從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,但是PFOS未能造成腎臟損傷。CCFM737除了與CCFM738同樣具有抗氧化功效以外,它還可以調(diào)節(jié)Nrf2表達(dá)量,從而促使機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激,這說明CCFM737在緩解PFOS造成的氧化損傷方面表現(xiàn)出比槲皮素更好的效果。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：TS201.3

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本文編號(hào)：2387831