【摘要】：全氟及多氟烷基化合物(Per-and polyfluoroalkyl substances,PFASs),是新型持久性有機污染物的一種,以其生物毒性大、化學和熱穩(wěn)定性強、生物難降解、環(huán)境分布廣等特點,且部分PFASs可通過生物蓄積和食物鏈在生物體內不斷富集,并在人和動物體內廣泛檢出,所造成的危害己被廣泛關注。針對PFASs進入機體后難以排出,通過誘導機體氧化造成機體毒性損傷。而迄今罕有緩解PFASs毒害的臨床藥物,其中膽汁酸螯合劑存在較大副作用,且安全性和有效性有待系統(tǒng)研究。較于螯合劑方法在中毒后的被動治療,膳食策略可為PFASs危害前主動地預防提供新解決途徑,但目前具有緩解PFASs毒性效果的膳食因子如抗氧化植物化合物等均需較大的攝入量才有效,而大量攝入帶來的風險也很難評估�？紤]到乳酸菌對黃曲霉毒素、重金屬等具有吸附作用,抗氧化性強等優(yōu)點,使其具備緩解PFASs危害的潛力,但尚未見乳酸菌緩解PFASs毒性的研究。鑒于此,本課題針對典型PFASs—全氟辛酸(Perfluorooctanoate,PFOA)和全氟辛烷磺酸(Perfluorooctane sulfonate,PFOS)的危害,發(fā)展快速、準確篩選高抗氧化性乳酸菌的細胞抗氧化模型,并將有應用潛力的乳酸菌通過動物模型驗證其功能并研究其作用機制。主要結果如下:首先發(fā)展細胞抗氧化方法(Cellular antioxidant activity,CAA)評價乳酸菌抗氧化活性,通過比較不同濃度(107、108和109 CFU/m L)下乳酸菌菌株的抗氧化活性,發(fā)現(xiàn)109 CFU/m L乳酸菌菌株的CAA活性高于107和108 CFU/m L。并將CAA與4種常見的乳酸菌抗氧化活性評價方法:DPPH自由基清除活性、羥自由基清除活性、還原能力、抑制脂質過氧化活性進行比較,結果表明CAA與4種化學方法得到的結果是一致的。由于CAA是在細胞水平進行的,比化學方法更接近體內,較適合篩選出體內高抗氧化活性乳酸菌。進一步建立了RAW264.7、Caco-2和EA.hy926細胞模型的CAA活性分析,結果表明3種細胞模型相關性較好,可用于乳酸菌抗氧化活性的分析。然后復篩得到耐受PFOA、PFOS的25株乳酸菌菌株,并分析菌株對PFOA、PFOS的吸附活性、耐酸耐膽鹽活性、細胞抗氧化活性以及粘附特性,最終篩選到L.plantarum CCFM738可在pH 3.0,6 h內吸附初始濃度50 mg/L的PFOA 49.40%±1.5%,并有很高的細胞抗氧化活性(11.89±1.1μM Quercetin),具有潛在緩解PFOA毒性的可能。而L.plantarum CCFM737可在pH 7.0,6 h內吸附初始濃度為50 mg/L的PFOS 60.00%±1.5%,并有很強的細胞抗氧化活性(9.87±0.98μM Quercetin),具有潛在緩解PFOS毒性的可能。進一步研究了L.plantarum CCFM738對PFOA,L.plantarum CCFM737對PFOS的吸附特性,探究了時間、pH對菌株吸附PFOA、PFOS的影響。系統(tǒng)研究了PFOA、PFOS對C57BL/6J雄性小鼠的急性和亞慢性毒性。結果發(fā)現(xiàn)PFOA、PFOS對小鼠的半數致死劑量(LD50)分別為0.457 g/kg BW和0.579 g/kg BW。在PFOA的亞慢性毒性實驗中,小鼠連續(xù)30天灌胃0.075、0.15和0.3 g PFOA/kg BW,結果造模組與對照組相比,造模組PFOA小鼠的食物攝入量、體重、腎臟比和脾臟比明顯降低(p0.05),肝臟比明顯增加(p0.05)。病理學觀察發(fā)現(xiàn)肝臟和腎臟有明顯的損害,而脾臟有輕微出血現(xiàn)象。PFOA造模組結果表明小鼠血液生化指標、尿液相關指標、氧化應激參數以及組織病理學發(fā)生明顯改變。小鼠暴露于PFOS 30天(2.5、5和10 mg PFOS/kg BW/day),打亂了小鼠抗氧化代謝系統(tǒng),誘導肝臟細胞凋亡,引起肝臟損傷,最終小鼠肝臟增大、重量增加,明確了PFOS對小鼠的肝臟毒性;與肝臟的明顯變化相比,腎臟的大小、腎臟損傷的標記物,以及腎臟組織切片觀察均無明顯變化。建立飼喂L.plantarum CCFM738對急性PFOA暴露小鼠毒性的緩解效果。相比于急性PFOA暴露造模組小鼠,丙二醛(Malondialdehyde,MDA)活性降低、抗氧化酶活性增加、血清酶活降低、炎癥因子抑制、病理學改變減弱,都表明CCFM738可以緩解PFOA造成的肝臟損傷。分別設立預防組和治療組,發(fā)現(xiàn)治療組效果低于預防組,原因在于,治療組緩解腎臟損傷作用較弱,并改善小鼠氧化損傷較小,因此對于PFOA造成的急性損傷修復能力低于預防組。相比于急性PFOS造模組小鼠,飼喂CCFM737(1×109 CFU/天)能顯著降低小鼠的肝臟體重指數,提高小鼠糞便PFOS含量、降低肝臟PFOS含量、恢復PFOS暴露導致的氧化應激相關指標的變化,并減輕急性PFOS毒性導致的組織病理損傷。然而CCFM737干預的預防組和治療組對于尿液中PFOS含量無明顯改變,這也表明CCFM737緩解PFOS損傷的靶點在于肝臟,而對于腎臟的緩解作用較弱。通過研究PFOA對小鼠亞慢性毒性,闡明PFOA的毒性機制。一方面是升高的MDA活性引發(fā)脂質過氧化,從而導致酰基輔酶A氧化酶(Palmitoyl CoA oxidase,ACOX)活性顯著增加,使得機體過氧化酶體增加,從而導致機體抗氧化酶活性降低,ROS產生,造成機體肝臟損傷。另一方面是通過過氧化物酶體增殖,從而造成小鼠脾臟的萎縮,小鼠免疫能力改變,血清細胞因子的改變。而且PFOA亞慢性預防組和治療組的造模癥狀是不同的,PFOA造模引起的預防組的腎臟比重和脾臟比重顯著高于治療組。而且在PFOA亞慢性毒性暴露中,預防組會造成小鼠肝臟、腎臟損傷,而治療組未能造成小鼠腎臟損傷。但相較于PFOA亞慢性造模組,乳酸菌CCFM738明顯的降低了MDA活性,降低了升高的ACOX活性,而且加上乳酸菌的的吸附作用,使得其明顯的改善了PFOA亞慢性暴露引起的肝臟損傷(升高的血清酶活)、腎臟損傷、以及脾臟萎縮引起的免疫損傷。PFOS亞慢性毒性與PFOA相似的是均可以通過升高MDA活性,誘導脂質過氧化,進一步導致ACOX活性顯著提高,使得機體損傷,不同的是PFOS亞慢性毒性會上調MAPKs信號通路相關激酶表達量,從而導致細胞凋亡,但是PFOS未能造成腎臟損傷。CCFM737除了與CCFM738同樣具有抗氧化功效以外,它還可以調節(jié)Nrf2表達量,從而促使機體產生氧化應激,這說明CCFM737在緩解PFOS造成的氧化損傷方面表現(xiàn)出比槲皮素更好的效果。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：TS201.3

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本文編號：2387831