本文選題：枯草芽孢桿菌 + 芽孢　； 參考：《中國農(nóng)業(yè)大學》2017年博士論文

【摘要】：本論文以Bacillussubtilis芽孢為研究對象,重點研究了高壓二氧化碳(high pressure CO2,HPCD)結合較低溫度(60-90℃)(mild-temperature treatment,MT)(HPCD + MT)處理對B.subti is芽孢的殺滅動力學和機制,同時研究了 HPCD + MT結合nisin對B.subtilis芽孢的殺滅效果,并對殺滅機制進行了探究,為HPCD + MT在食品殺菌中的應用提供了理論基礎。具體研究內(nèi)容和結果如下:(1)研究了 HPCD + MT處理中的溫度、壓力、酸效應和CO2的分子效應對B.subtilis芽孢的殺滅效果,以及HPCD + MT在不同溫度壓力條件下對B.subtilis芽孢的殺滅效果和動力學。試驗中選取HPCD + MT處理壓力為6.5-25 MPa,溫度為44-91℃,時間為0-120min,同時以0.1 MPa下82-91℃熱處理作為對比。試驗測定了 HPCD + MT處理過程中芽孢存活率、吡啶-2,6-二羧酸(dipicolinic acid,DPA)的釋放和芽孢的粒度變化。研究結果表明HPCD + MT對芽孢的殺滅作用是溫度、壓力、酸效應和CO2分子效應綜合作用的結果,而不是某一種效應單獨作用的結果。通過對比HPCD + MT和熱處理對芽孢的殺滅效果發(fā)現(xiàn),相同溫度下HPCD + MT處理比熱處理能更有效的殺滅芽孢。HPCD + MT對芽孢的殺滅效果隨著壓力、溫度的升高,或時間的延長而提高,然而當壓力高于15MPa時,殺滅效果反而下降,出現(xiàn)了保護效應。HPCD + MT對芽孢的殺滅動力學曲線根據(jù)處理壓力的不同表現(xiàn)為兩種類型:(i)壓力為6.5和10 MPa時,曲線為兩段式,包括延滯期和快速殺菌期;(ii)壓力為15-25 MPa時,曲線為三段式,包括延滯期、快速殺菌期和拖尾期,拖尾期再次表明芽孢在HPCD + MT處理過程中出現(xiàn)了保護效應。對芽孢粒度研究發(fā)現(xiàn),HPCD + MT處理過程中芽孢發(fā)生聚集,通過添加0.1%的表面活性劑Tween80可以有效降低芽孢的聚集程度,同時提高HPCD + MT對芽孢的殺滅效果,這表明HPCD + MT處理過程中的保護效應是由芽孢的聚集導致。對DPA研究發(fā)現(xiàn),HPCD + MT處理過程中芽孢的死亡伴隨著大量DPA的釋放,這表明HPCD + MT處理過程中芽孢發(fā)生了萌發(fā)或芽孢內(nèi)膜被破壞。(2)研究了 HPCD + MT處理過程中B.subtilis芽孢的萌發(fā)和結構的破壞。試驗選取HPCD +MT處理條件為6.5-20MPa,64-86℃,0-60min,同時以0.1MPa下86℃熱處理作為對比。試驗測定了 HPCD + MT處理過程中芽孢熱抗性損失、DPA釋放、芽孢皮層和內(nèi)膜透性的變化,并觀察了芽孢外部形態(tài)和內(nèi)部結構的變化。研究發(fā)現(xiàn)HPCD + MT處理后的芽孢熱抗性沒有損失,同時HPCD + MT處理過程中DPA的釋放速率總是低于芽孢的殺滅速率,表明HPCD + MT處理過程中芽孢沒有發(fā)生萌發(fā)。流式分析結果表明HPCD + MT處理后芽孢的皮層和芽孢內(nèi)膜透性增加,而HPCD + MT處理過程中芽孢的死亡伴隨著大量DPA的釋放,同時HPCD + MT處理后的大量芽孢被PI染色,進一步證實芽孢內(nèi)膜透性增加。掃描電鏡結果顯示HPCD + MT處理后芽孢表面出現(xiàn)褶皺、凹陷、破損甚至破裂,透射電鏡結果顯示HPCD + MT處理后芽孢的芽孢衣、皮層、芽孢內(nèi)膜和芽孢核出現(xiàn)不同程度的破壞。上述研究結果表明HPCD + MT處理不是通過誘導芽孢萌發(fā),而是通過破壞芽孢結構殺滅芽孢。(3)研究了 HPCD + MT處理對B.subtilis芽孢不同結構的破壞,并對導致芽孢死亡的關鍵事件進行深入探究。試驗選取HPCD + MT處理壓力為20 MPa,溫度為84-86℃,時間為0-60 min,同時以0.1 MPa下86℃熱處理作為對比。試驗測定HPCD + MT處理后芽孢衣、芽孢內(nèi)膜、芽孢核內(nèi)蛋白和DNA的破壞,以及芽孢的萌發(fā)和生長特性。對HPCD + MT處理的芽孢進行密度梯度離心分離,得到的芽孢存活率僅為0.17%,而DPA含量高達97.9%,即一部分被HPCD + MT殺滅的芽孢保留了 DPA,表明HPCD + MT處理不是通過使芽孢內(nèi)膜破裂殺滅芽孢。后續(xù)將對HPCD + MT處理后死亡但保留了 DPA的芽孢進行研究。對萌發(fā)特性的研究結果顯示,HPCD +MT處理后芽孢在L-valine或AGFK誘導下仍能夠萌發(fā),且最大萌發(fā)率遠高于芽孢存活率,表明一部分死亡的芽孢也能萌發(fā),因此HPCD + MT不是通過破壞芽孢內(nèi)膜上萌發(fā)受體蛋白GerA、GerB或GerK殺滅芽孢。需要注意的是,在十二烷胺(dodecylamine,DDA)的誘導下HPCD + MT處理后芽孢的萌發(fā)速率反而升高,這一方面表明HPCD + MT對DPA釋放通道蛋白SpoVA沒有破壞,另一方面也表明HPCD + MT的作用加快了 DDA與SpoVA蛋白的作用。進一步研究表明,這種DDA誘導的芽孢萌發(fā)速率的升高是由于HPCD + MT破壞了芽孢衣,加快了 DDA進入芽孢內(nèi)膜與SpoVA蛋白作用導致。對芽孢核內(nèi)蛋白研究結果顯示,HPCD + MT處理破壞了芽孢核內(nèi)的GFP蛋白,但破壞程度要遠低于芽孢的殺滅率,這表明HPCD + MT不是通過破壞芽孢核內(nèi)蛋白殺滅芽孢。對芽孢DNA的研究結果顯示,HPCD + MT處理后芽孢中沒有出現(xiàn)突變菌體,表明HPCD + MT不是通過破壞DNA殺滅芽孢。對芽孢內(nèi)膜特性研究結果顯示,HPCD + MT處理后芽孢對高滲環(huán)境抗性和對DPA的維持能力下降,并且萌發(fā)后均能被PI染色,而對芽孢生長特性研究結果顯示,芽孢萌發(fā)后生長過程受阻。上述結果表明HPCD + MT處理對芽孢內(nèi)膜造成損傷,導致芽孢萌發(fā)后不能正常生長而被殺滅。(4)研究了 HPCD + MT結合nisin對B.subtilis芽孢的殺滅效果和機制。試驗選取HPCD +MT處理條件為6.5或20MPa,84-86℃,0-30min,nisin處理濃度為0.02%。處理方式包括HPCD+ MT 結合 nisin(HPCD + MT + nisin)、先 HPCD + MT 處理后 nisin 處理(HPCD + MT→nisin)、先nisin處理后HPCD處理(nisin→HPCD + MT)。試驗測定了 HPCD + MT + nisin處理后芽孢存活率、芽孢內(nèi)膜的透性和芽孢結構的破壞。研究結果顯示HPCD + nisin對芽孢具有協(xié)同殺滅效果,且殺滅效果HPCD + MT +nisin高于HPCD+MT→nisin或nisin→HPCD+MT。對DPA研究顯示HPCD + MT + nisin處理提高了芽孢DPA釋放速率,流失分析結果顯示HPCD + MT + nisin處理提高了芽孢被PI染色的比例,上述結果表明,與單獨HPCD + MT處理相比,HPCD + MT +nisin處理對芽孢內(nèi)膜的破壞作用增加。綜上,HPCD + MT + nisin對芽孢的殺滅機制如下:HPCD+ MT破壞了芽孢結構,nisin進入芽孢內(nèi)部作用于芽孢內(nèi)膜,提高了對芽孢內(nèi)膜的損傷,導致更高的殺滅速率。
[Abstract]:The killing effect of HPCD + MT on B . subtilis was studied . The results were as follows : ( 1 ) The killing effect of HPCD + MT on B . subtilis was studied . The results showed that the killing effect of HPCD + MT was 6.5 -25 MPa , the temperature was 44 - 91 鈩，

本文編號：2023700