本文選題：枯草芽孢桿菌 + 芽孢��； 參考：《中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：本論文以Bacillussubtilis芽孢為研究對(duì)象,重點(diǎn)研究了高壓二氧化碳(high pressure CO2,HPCD)結(jié)合較低溫度(60-90℃)(mild-temperature treatment,MT)(HPCD + MT)處理對(duì)B.subti is芽孢的殺滅動(dòng)力學(xué)和機(jī)制,同時(shí)研究了 HPCD + MT結(jié)合nisin對(duì)B.subtilis芽孢的殺滅效果,并對(duì)殺滅機(jī)制進(jìn)行了探究,為HPCD + MT在食品殺菌中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:(1)研究了 HPCD + MT處理中的溫度、壓力、酸效應(yīng)和CO2的分子效應(yīng)對(duì)B.subtilis芽孢的殺滅效果,以及HPCD + MT在不同溫度壓力條件下對(duì)B.subtilis芽孢的殺滅效果和動(dòng)力學(xué)。試驗(yàn)中選取HPCD + MT處理壓力為6.5-25 MPa,溫度為44-91℃,時(shí)間為0-120min,同時(shí)以0.1 MPa下82-91℃熱處理作為對(duì)比。試驗(yàn)測(cè)定了 HPCD + MT處理過(guò)程中芽孢存活率、吡啶-2,6-二羧酸(dipicolinic acid,DPA)的釋放和芽孢的粒度變化。研究結(jié)果表明HPCD + MT對(duì)芽孢的殺滅作用是溫度、壓力、酸效應(yīng)和CO2分子效應(yīng)綜合作用的結(jié)果,而不是某一種效應(yīng)單獨(dú)作用的結(jié)果。通過(guò)對(duì)比HPCD + MT和熱處理對(duì)芽孢的殺滅效果發(fā)現(xiàn),相同溫度下HPCD + MT處理比熱處理能更有效的殺滅芽孢。HPCD + MT對(duì)芽孢的殺滅效果隨著壓力、溫度的升高,或時(shí)間的延長(zhǎng)而提高,然而當(dāng)壓力高于15MPa時(shí),殺滅效果反而下降,出現(xiàn)了保護(hù)效應(yīng)。HPCD + MT對(duì)芽孢的殺滅動(dòng)力學(xué)曲線根據(jù)處理壓力的不同表現(xiàn)為兩種類型:(i)壓力為6.5和10 MPa時(shí),曲線為兩段式,包括延滯期和快速殺菌期;(ii)壓力為15-25 MPa時(shí),曲線為三段式,包括延滯期、快速殺菌期和拖尾期,拖尾期再次表明芽孢在HPCD + MT處理過(guò)程中出現(xiàn)了保護(hù)效應(yīng)。對(duì)芽孢粒度研究發(fā)現(xiàn),HPCD + MT處理過(guò)程中芽孢發(fā)生聚集,通過(guò)添加0.1%的表面活性劑Tween80可以有效降低芽孢的聚集程度,同時(shí)提高HPCD + MT對(duì)芽孢的殺滅效果,這表明HPCD + MT處理過(guò)程中的保護(hù)效應(yīng)是由芽孢的聚集導(dǎo)致。對(duì)DPA研究發(fā)現(xiàn),HPCD + MT處理過(guò)程中芽孢的死亡伴隨著大量DPA的釋放,這表明HPCD + MT處理過(guò)程中芽孢發(fā)生了萌發(fā)或芽孢內(nèi)膜被破壞。(2)研究了 HPCD + MT處理過(guò)程中B.subtilis芽孢的萌發(fā)和結(jié)構(gòu)的破壞。試驗(yàn)選取HPCD +MT處理?xiàng)l件為6.5-20MPa,64-86℃,0-60min,同時(shí)以0.1MPa下86℃熱處理作為對(duì)比。試驗(yàn)測(cè)定了 HPCD + MT處理過(guò)程中芽孢熱抗性損失、DPA釋放、芽孢皮層和內(nèi)膜透性的變化,并觀察了芽孢外部形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化。研究發(fā)現(xiàn)HPCD + MT處理后的芽孢熱抗性沒有損失,同時(shí)HPCD + MT處理過(guò)程中DPA的釋放速率總是低于芽孢的殺滅速率,表明HPCD + MT處理過(guò)程中芽孢沒有發(fā)生萌發(fā)。流式分析結(jié)果表明HPCD + MT處理后芽孢的皮層和芽孢內(nèi)膜透性增加,而HPCD + MT處理過(guò)程中芽孢的死亡伴隨著大量DPA的釋放,同時(shí)HPCD + MT處理后的大量芽孢被PI染色,進(jìn)一步證實(shí)芽孢內(nèi)膜透性增加。掃描電鏡結(jié)果顯示HPCD + MT處理后芽孢表面出現(xiàn)褶皺、凹陷、破損甚至破裂,透射電鏡結(jié)果顯示HPCD + MT處理后芽孢的芽孢衣、皮層、芽孢內(nèi)膜和芽孢核出現(xiàn)不同程度的破壞。上述研究結(jié)果表明HPCD + MT處理不是通過(guò)誘導(dǎo)芽孢萌發(fā),而是通過(guò)破壞芽孢結(jié)構(gòu)殺滅芽孢。(3)研究了 HPCD + MT處理對(duì)B.subtilis芽孢不同結(jié)構(gòu)的破壞,并對(duì)導(dǎo)致芽孢死亡的關(guān)鍵事件進(jìn)行深入探究。試驗(yàn)選取HPCD + MT處理壓力為20 MPa,溫度為84-86℃,時(shí)間為0-60 min,同時(shí)以0.1 MPa下86℃熱處理作為對(duì)比。試驗(yàn)測(cè)定HPCD + MT處理后芽孢衣、芽孢內(nèi)膜、芽孢核內(nèi)蛋白和DNA的破壞,以及芽孢的萌發(fā)和生長(zhǎng)特性。對(duì)HPCD + MT處理的芽孢進(jìn)行密度梯度離心分離,得到的芽孢存活率僅為0.17%,而DPA含量高達(dá)97.9%,即一部分被HPCD + MT殺滅的芽孢保留了 DPA,表明HPCD + MT處理不是通過(guò)使芽孢內(nèi)膜破裂殺滅芽孢。后續(xù)將對(duì)HPCD + MT處理后死亡但保留了 DPA的芽孢進(jìn)行研究。對(duì)萌發(fā)特性的研究結(jié)果顯示,HPCD +MT處理后芽孢在L-valine或AGFK誘導(dǎo)下仍能夠萌發(fā),且最大萌發(fā)率遠(yuǎn)高于芽孢存活率,表明一部分死亡的芽孢也能萌發(fā),因此HPCD + MT不是通過(guò)破壞芽孢內(nèi)膜上萌發(fā)受體蛋白GerA、GerB或GerK殺滅芽孢。需要注意的是,在十二烷胺(dodecylamine,DDA)的誘導(dǎo)下HPCD + MT處理后芽孢的萌發(fā)速率反而升高,這一方面表明HPCD + MT對(duì)DPA釋放通道蛋白SpoVA沒有破壞,另一方面也表明HPCD + MT的作用加快了 DDA與SpoVA蛋白的作用。進(jìn)一步研究表明,這種DDA誘導(dǎo)的芽孢萌發(fā)速率的升高是由于HPCD + MT破壞了芽孢衣,加快了 DDA進(jìn)入芽孢內(nèi)膜與SpoVA蛋白作用導(dǎo)致。對(duì)芽孢核內(nèi)蛋白研究結(jié)果顯示,HPCD + MT處理破壞了芽孢核內(nèi)的GFP蛋白,但破壞程度要遠(yuǎn)低于芽孢的殺滅率,這表明HPCD + MT不是通過(guò)破壞芽孢核內(nèi)蛋白殺滅芽孢。對(duì)芽孢DNA的研究結(jié)果顯示,HPCD + MT處理后芽孢中沒有出現(xiàn)突變菌體,表明HPCD + MT不是通過(guò)破壞DNA殺滅芽孢。對(duì)芽孢內(nèi)膜特性研究結(jié)果顯示,HPCD + MT處理后芽孢對(duì)高滲環(huán)境抗性和對(duì)DPA的維持能力下降,并且萌發(fā)后均能被PI染色,而對(duì)芽孢生長(zhǎng)特性研究結(jié)果顯示,芽孢萌發(fā)后生長(zhǎng)過(guò)程受阻。上述結(jié)果表明HPCD + MT處理對(duì)芽孢內(nèi)膜造成損傷,導(dǎo)致芽孢萌發(fā)后不能正常生長(zhǎng)而被殺滅。(4)研究了 HPCD + MT結(jié)合nisin對(duì)B.subtilis芽孢的殺滅效果和機(jī)制。試驗(yàn)選取HPCD +MT處理?xiàng)l件為6.5或20MPa,84-86℃,0-30min,nisin處理濃度為0.02%。處理方式包括HPCD+ MT 結(jié)合 nisin(HPCD + MT + nisin)、先 HPCD + MT 處理后 nisin 處理(HPCD + MT→nisin)、先nisin處理后HPCD處理(nisin→HPCD + MT)。試驗(yàn)測(cè)定了 HPCD + MT + nisin處理后芽孢存活率、芽孢內(nèi)膜的透性和芽孢結(jié)構(gòu)的破壞。研究結(jié)果顯示HPCD + nisin對(duì)芽孢具有協(xié)同殺滅效果,且殺滅效果HPCD + MT +nisin高于HPCD+MT→nisin或nisin→HPCD+MT。對(duì)DPA研究顯示HPCD + MT + nisin處理提高了芽孢DPA釋放速率,流失分析結(jié)果顯示HPCD + MT + nisin處理提高了芽孢被PI染色的比例,上述結(jié)果表明,與單獨(dú)HPCD + MT處理相比,HPCD + MT +nisin處理對(duì)芽孢內(nèi)膜的破壞作用增加。綜上,HPCD + MT + nisin對(duì)芽孢的殺滅機(jī)制如下:HPCD+ MT破壞了芽孢結(jié)構(gòu),nisin進(jìn)入芽孢內(nèi)部作用于芽孢內(nèi)膜,提高了對(duì)芽孢內(nèi)膜的損傷,導(dǎo)致更高的殺滅速率。
[Abstract]:The killing effect of HPCD + MT on B . subtilis was studied . The results were as follows : ( 1 ) The killing effect of HPCD + MT on B . subtilis was studied . The results showed that the killing effect of HPCD + MT was 6.5 -25 MPa , the temperature was 44 - 91 鈩，

本文編號(hào)：2023700