本文選題：偶氮染料 + 偶氮還原酶��； 參考：《中國科學院武漢植物園》2017年博士論文

【摘要】：紡織業(yè)和印染業(yè)是我國染料使用的主要行業(yè)。隨著染料用量的逐年增加,染料廢水排放導致的環(huán)境污染問題也日益凸顯。目前,印染業(yè)使用的染料包含大量人工合成的偶氮染料。偶氮染料的結構比較穩(wěn)定,自然條件下能夠抗堿、抗酸和抗光降解。排放到環(huán)境中且含偶氮染料的廢水對生物體具有潛在的三致效應(致癌、致畸、致突變)。希瓦氏菌屬的模式生物ShewanellaoneidensisMR-1在微氧條件下能夠降解偶氮染料,但降解過程在好氧條件下被抑制。目前,關于S.oneidensisMR-1偶氮還原過程的機理以及氧抑制該偶氮還原過程的機理研究甚少。此外,作為降解偶氮染料的關鍵酶,蛋白質數(shù)據(jù)庫中暫無S.oneidensis MR-1偶氮還原酶(soAzoR)的晶體結構。因此,有關soAzoR的活性位點以及其與底物等的相互作用方式研究也較少。為闡明上述機制,本研究采用基于NMR的代謝組技術和基于RNA-Seq的轉錄組技術分析了Soneidensis MR-1在不同氧條件下以甲基橙為底物時代謝水平和轉錄水平的變化;采用同源建模、分子對接以及單氨基酸突點等方法分析了 soAzoR與FMN、NADH和底物(甲基紅)的作用方式及作用位點。主要研究結果如下:(1)在代謝組水平上:S.oneidensisMR-l在低濃度溶解氧條件下培養(yǎng)時,甲基橙的存在與否對代謝物含量無顯著影響(p0.05)。甲基橙濃度相同時,溶解氧濃度的增加導致SoneidensisMR-1細胞內8種代謝物(脂蛋白脂、丙氨酸、乙酸異戊酯、異丙醇、別蘇氨酸、3-羥基丁酮、丙氨酸、腐胺和NAD+)的含量顯著性增加(p0.05)。(2)在轉錄組水平上:SoneidensisMR-1在低濃度溶解氧條件下培養(yǎng)時,甲基橙的存在導致146個基因上調,26個基因下調;SoneidensisMR-1糖代謝能力,TCA循環(huán)能力,氨基酸降解能力和電子傳遞能力增加,尿素循環(huán)能力和合成精氨酸能力降低。甲基橙濃度相同時,溶解氧濃度的增加導致S.oneidensis MR-1的312個基因上調,759個基因下調;SoneidensisMR-1脂肪酸氧化能力、氨基酸合成能力、DNA復制能力和尿素循環(huán)的能力增加,TCA循環(huán)能力、電子傳遞能力以及氨基酸降解能力降低。(3)結合代謝組和轉錄組數(shù)據(jù)提出假設:soAzoR與呼吸鏈電子傳遞復合體I想毗鄰,偶氮還原過程可以看作呼吸電子傳遞的一個分支;氧分子作為呼吸電子傳遞鏈的終端電子受體,與偶氮染料競爭性的接受電子。(4)soAzoR的三維結構一共包含6個α-螺旋和7個β-折疊,采用典型的羅斯曼折疊構象,酶的活性口袋只能通過同源二聚體形成。(5)輔基FMN的異咯嗪環(huán)以平面的方式結合在soAzoR的疏水性口袋中。FMN分別與來自于單體B的氨基酸殘基Met94、Tyr95、Asn96、Phe97、Gly140、Gly141、Gly143、Thr138、Ser10、Ser16、Gln17、Ser18 之間生成氫鍵;與來自單體B的氨基酸殘基Leu12、Pro93、Asn176、Arg139以及來自單體A的氨基酸殘基Leu8之間均有疏水性作用。(6)輔酶NADH的煙酰胺基團和腺嘌呤核苷酸基團分別結合與酶的不同部位。煙酰胺基團結合于FMN的異咯嗪環(huán)si面上方的疏水性口袋中并與該平面呈一定的角度。煙酰胺C4原子到FMN異咯嗪環(huán)N5原子之間的距離為4.3 A。NADH分別與來自單體A的氨基酸殘基Ala111、Tyr119、Arg59以及來自單體B的氨基酸殘基Ser16之間生成氫鍵;與來自單體A的氨基酸殘基Leu58、Phe117、Phe161以及來自單體B的氨基酸殘基Gln17、Tyr15之間均有疏水性作用。(7)甲基紅(MR)的對氨基苯基團平面以與FMN異咯嗪環(huán)si面呈30°角的模式結合在soAzoR的疏水性口袋中。偶氮鍵到FMN異咯嗪環(huán)N5原子的距離約為4.6A。MR分別與氨基酸殘基Asn96(B)、Gly140(B)、Gly141(B)、以及氨基酸殘基Tyr119(A)之間生成氫鍵;與氨基酸殘基Tyr95(B)、Phe97(B)以及氨基酸殘基Phe1 17(A)、Phe161(A)之間均有疏水性作用。(8)酶動力參數(shù)分析結果顯示:與野生型酶相比,突變體G140F和G141F完全喪失了降解甲基紅的能力;突變體S16A和N96A的甲基紅和NADH親和力均降低至少50%;突變體F161A徹底活性;突變體F117A的NADH親和性提高,且降解甲基紅和利用NADH的活性也同時提高;突變體Y119A的NADH親和力降低;突變體R139A對甲基紅的親和性降低至少4倍,而對NADH親和力基本不變;突變體H143A降解染料的活性降低至19%,對甲基紅的親和力也大幅降低;突變體R59A對降解甲基紅和利用NADH的能力影響較小。
[Abstract]:The textile industry and printing and dyeing industry are the main industries for the use of dyes in our country . With the increasing of dye consumption , the problem of environmental pollution caused by the discharge of dye wastewater is becoming more and more prominent . At present , the dyes used in printing and dyeing industry contain a large number of azo dyes artificially synthesized . The structure of azo dyes is stable and can resist alkali , acid and light degradation under natural conditions . The results were as follows : ( 1 ) When the concentration of methyl orange is the same , the increase of dissolved oxygen concentration leads to up - regulation of the metabolic level and transcription level in the presence or absence of S . oneidensis MR - 1 under different oxygen conditions . ( 5 ) The three - dimensional structure of coenzyme NADH contains 6 alpha - helix and 7 尾 - folds . The distance between nicotinamide and amino acid residues Leu12 , Tyr95 , Asn96 , Phe97 , Ser10 , Ser16 , Gln17 , Ser18 and amino acid residues Leu8 from monomer A are respectively bonded to different parts of enzyme . ( 7 ) The p - aminophenyl group plane of methyl red ( MR ) was bonded to the hydrophobic pouch of soxR at 30 擄 angle with the FMN isoalloxazine ring si . The distance between the azo bond and the amino acid residues Asn96 ( B ) , Gly140 ( B ) , Gly141 ( B ) , and Phe161 ( A ) was reduced at least 50 % ; the affinity of mutant strain F161A was reduced ; the activity of mutant R139A decreased to 19 % , the affinity of mutant H143A was reduced to 19 % , and the affinity of mutant R59A to degradation methyl red and utilization of NADH was less .

【學位授予單位】：中國科學院武漢植物園
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：X791

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本文編號：1849459