本文選題：DNA甲基轉(zhuǎn)移酶　切入點(diǎn)：DNA探針　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltransferase,DNAMTase)是存在于表觀(guān)遺傳學(xué)中的一種修飾蛋白酶,其通過(guò)催化DNA甲基化過(guò)程而參與許多生物學(xué)過(guò)程并在其中發(fā)揮重要作用,如調(diào)節(jié)基因的表達(dá)和發(fā)育等。然而,DNAMTase活性的異常使得DNA甲基化表達(dá)水平異于常態(tài),且異于常態(tài)的DNA甲基化水平通過(guò)失活腫瘤的抑制基因或沉默基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄而引發(fā)多種類(lèi)型的疾病,如發(fā)育異常、自身免疫性疾病及多種類(lèi)型的癌癥等。因此,精確且靈敏的檢測(cè)DNAMTase活性對(duì)診斷疾病的發(fā)展階段和類(lèi)型具有指導(dǎo)價(jià)值。目前,核酸酶消化法因酶切反應(yīng)的高效特異性在DNAMTase活性的檢測(cè)中引起了極大的關(guān)注。在該方法中,作為識(shí)別探針的DNA探針經(jīng)目標(biāo)識(shí)別事件后,被核酸酶消化切割實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNAMTase的轉(zhuǎn)導(dǎo),繼而輔助以用于信號(hào)輸出的各種技術(shù)手段達(dá)到對(duì)目標(biāo)物的檢測(cè)。其中熒光技術(shù)輔助的生物傳感法以簡(jiǎn)單、快速及靈敏的特性被用于DNAMTase活性檢測(cè)中。但仍存在一些問(wèn)題需解決,即擴(kuò)增效率低、識(shí)別探針?lè)忾]不完全、轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低等問(wèn)題對(duì)改善現(xiàn)有靈敏度存在局限性,及檢測(cè)過(guò)程中所需過(guò)量輔助探針對(duì)信號(hào)造成的干擾,同時(shí)增加自身設(shè)計(jì)復(fù)雜性等問(wèn)題。以DNAMTase為研究模型,針對(duì)目前檢測(cè)方法中存在的上述問(wèn)題,本論文展開(kāi)了相關(guān)性的研究。本論文共分為六章,且將每個(gè)章節(jié)的主要內(nèi)容總結(jié)如下:第一章是緒論部分,主要概括闡述了 DNAMTase的含義、功能、分類(lèi)及研究意義。并且總結(jié)了 DNAMTase活性檢測(cè)的方法,對(duì)檢測(cè)中存在的問(wèn)題進(jìn)行了簡(jiǎn)單概括。此外,對(duì)目前熒光生物傳感法的原理、分類(lèi)及其生物學(xué)應(yīng)用進(jìn)行了歸納總結(jié)。第二章,基于鏈置換擴(kuò)增(strand displacement amplification,SDA)和DNAzyme擴(kuò)增反應(yīng),構(gòu)建了一種熒光雙擴(kuò)增策略靈敏檢測(cè)DNA MTase活性。首先,在所設(shè)計(jì)的雙鏈識(shí)別探針中引入SDA的引物和模板、DNAzyme的合成模板,將SDA和DNAzyme擴(kuò)增反應(yīng)有效的結(jié)合起來(lái)。其經(jīng)目標(biāo)物作用后,保持原有雙鏈結(jié)構(gòu)不變。其中的短鏈作為SDA的引物、長(zhǎng)鏈作為模板,在酶輔助下引發(fā)SDA反應(yīng)。而且識(shí)別探針中含有DNAzyme合成模板,這使得其經(jīng)上述擴(kuò)增反應(yīng)后合成游離的DNAzyme序列,繼而引發(fā)分子信標(biāo)底物的循環(huán)切割,釋放大量含熒光團(tuán)的短鏈,熒光信號(hào)得以恢復(fù),實(shí)現(xiàn)對(duì)DNAMTase活性的檢測(cè)。該策略將兩大擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)合,大大提高了擴(kuò)增效率,確保了檢測(cè)策略的高靈敏度,相應(yīng)的檢測(cè)限為0.0082 U/mL。第三章,以 SDA 和指數(shù)滾環(huán)擴(kuò)增(exponential rolling circle amplification,ERCA)反應(yīng)為基礎(chǔ),設(shè)計(jì)了一種環(huán)介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)擴(kuò)增策略超靈敏精確檢測(cè)DNA MTase活性。在該設(shè)計(jì)中,作為識(shí)別探針的長(zhǎng)莖環(huán)探針經(jīng)甲基化事件后,釋放環(huán)部及其附近區(qū)域,其作為引發(fā)后續(xù)過(guò)程的引發(fā)鏈。其中,長(zhǎng)莖環(huán)探針中的長(zhǎng)莖部區(qū)域有兩方面的作用:一方面維持探針的穩(wěn)定性或確保探針的有效形成,另一方面將引發(fā)鏈有效地封閉,以防出現(xiàn)探針泄漏引起的非特異擴(kuò)增。釋放的引發(fā)鏈與發(fā)夾探針雜交,進(jìn)而引發(fā)SDA反應(yīng),生成引物鏈。該引物鏈與含切割位點(diǎn)的掛鎖探針雜交,繼而觸發(fā)ERCA反應(yīng)。結(jié)合級(jí)聯(lián)擴(kuò)增反應(yīng)的高擴(kuò)增效率和長(zhǎng)莖環(huán)探針的高穩(wěn)定性?xún)纱筇攸c(diǎn),實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA MTase活性的高靈敏精確檢測(cè),檢測(cè)限低至 8.1×10-5U/mL。第四章,利用雙環(huán)探針對(duì)引物鏈的有效封閉作用,發(fā)展了一種多重封閉引物介導(dǎo)的滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplification,RCA)策略用于檢測(cè) DNA MTase的活性。我們?cè)O(shè)計(jì)了含多個(gè)引物鏈的雙環(huán)探針,其在DNAMTase作用下釋放多重轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈,該轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈作為引物(完整引物或分裂引物)觸發(fā)RCA反應(yīng)。這種存在于目標(biāo)物和轉(zhuǎn)導(dǎo)鏈間的1:N的轉(zhuǎn)導(dǎo)模式,其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高,有效改善了 DNA MTase活性檢測(cè)的靈敏度。且通過(guò)改變雙環(huán)探針中引物鏈的個(gè)數(shù),可對(duì)酶活性的檢測(cè)實(shí)現(xiàn)可控性。隨著雙環(huán)探針中封閉引物個(gè)數(shù)的增加,檢測(cè)靈敏度得到相應(yīng)的改善。且每增加一個(gè)封閉引物,檢測(cè)限大約降低一個(gè)數(shù)量級(jí)。將1:N轉(zhuǎn)導(dǎo)模式的高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和RCA反應(yīng)的高擴(kuò)增效率結(jié)合起來(lái),有效改善了酶活性檢測(cè)的靈敏度,檢測(cè)限最大程度低至0.0085 U/mL。當(dāng)封閉引物個(gè)數(shù)相同時(shí),相較于完整引物而言,分裂引物所引起的背景信號(hào)更低,其相應(yīng)的檢測(cè)限也稍微降低。第五章,基于構(gòu)象轉(zhuǎn)變機(jī)理,設(shè)計(jì)了一種一體化構(gòu)象可變式探針介導(dǎo)的SDA策略用于DNAMTase活性檢測(cè)。在作為識(shí)別探針的一體化構(gòu)象可變式探針中設(shè)計(jì)SDA反應(yīng)所需的引物和模板鏈。DNAMTase不存在時(shí),一體化構(gòu)象可變式探針將引物和模板鏈封閉。DNAMTase存在時(shí),探針被催化發(fā)生甲基化事件,其后經(jīng)核酸酶切割生成大環(huán)小莖的發(fā)夾探針。該發(fā)夾探針結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變而激活引物和模板鏈,觸發(fā)SDA反應(yīng)。該設(shè)計(jì)中,一體化構(gòu)象可變式探針將識(shí)別、轉(zhuǎn)導(dǎo)和信號(hào)輸出元素結(jié)合在一起,大大簡(jiǎn)化了探針設(shè)計(jì)過(guò)程中的難度。探針設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)便性和擴(kuò)增過(guò)程的強(qiáng)擴(kuò)增能力,益于酶活性的簡(jiǎn)單、靈敏檢測(cè),檢測(cè)限為 0.063 U/mL。第六章是本論文結(jié)論部分,主要包括工作總結(jié)及前景展望。
[Abstract]:DNA methylase ( DNAMTase ) is a kind of modified protease present in epigenetics , which is involved in many biological processes and plays an important role in the detection of DNAMTase by catalytic DNA methylation . In this paper , we designed a double loop probe with multiple primer chains , which can be used as primer ( complete primer or split primer ) to detect the activity of DNA MTase . This paper designs an integrated conformational variable probe - mediated SDA strategy for the detection of DNAMTase activity in the presence of DNAMTase .

【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：O657.3
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本文編號(hào)：1695196