本文選題：RNAi　切入點：陽離子化明膠微球　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景和目的:RNA干擾(RNAi)對于人類基因相關(guān)疾病的治療,特別是抗腫瘤治療具有重要的意義。迄今RNAi的作用機(jī)理已經(jīng)非常明晰,并且有多種核酸藥物(siRNA、shRNA、miRNA、dsiRNA)和核酸遞送載體(病毒、脂質(zhì)體、陽離子聚合物、金屬或無機(jī)納米顆粒等)得到廣泛關(guān)注與研究。常用的核酸遞送載體主要包括病毒載體和非病毒載體。病毒載體轉(zhuǎn)染率高,但存在核酸裝載量有限以及具有免疫原性和安全性風(fēng)險等問題;非病毒載體安全、穩(wěn)定,但轉(zhuǎn)染效率相對較低。因此,構(gòu)建安全、高效的非病毒核酸遞送載體是RNAi技術(shù)研發(fā)中面臨的一個重要挑戰(zhàn)。明膠來源于動物的皮膚和骨骼,可生物降解,并具有生物相容性好和易被化學(xué)修飾等特點,是制備藥物載體的一種重要生物材料。本課題的總體思路是合成陽離子化明膠分子,對傳統(tǒng)兩步溶解法進(jìn)行改進(jìn),制備出尺寸分布均一的陽離子化明膠微球(cationic gelatin nanoparticles,CGN);其目的是保護(hù)核酸物質(zhì)免于核酸酶降解,同時,實現(xiàn)核酸藥物緩釋而延長其作用時間。通過細(xì)胞實驗探究陽離子化明膠分子的交聯(lián)度、培養(yǎng)基中血清濃度以及細(xì)胞種類等因素對陽離子化明膠微球介導(dǎo)CXCR4 siRNA發(fā)揮干擾效果的影響規(guī)律。方法:通過向明膠分子中導(dǎo)入乙二胺制備陽離子化明膠;以戊二醛為交聯(lián)劑,通過對傳統(tǒng)兩步溶解法進(jìn)行改進(jìn)來制備不同交聯(lián)度的陽離子化明膠微球(CGN),并以非陽離子化明膠微球(gelatin nanoparticles,GN)作為對照。采用掃描電子顯微鏡(SEM)、原子力顯微鏡(AFM)、動態(tài)光散射(DLS)等方法對CGN形貌、尺寸及其在水溶液中的水合粒徑、Zeta電位等參數(shù)進(jìn)行表征和檢測。使用1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測CGN與siRNA的結(jié)合,采用DLS法檢測CGN與siRNA復(fù)合物(CGN@siRNA)的水合粒徑和Zeta電位。采用CCK8法檢測GN、CGN、CGN@siRNA對小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1的細(xì)胞毒性,以及血清含量對細(xì)胞活性的影響。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測CGN@siRNA的細(xì)胞攝取情況;通過激光共聚焦顯微鏡(confocal)觀察CGN@siRNA在細(xì)胞中的定位。采用Real Time PCR方法在腫瘤細(xì)胞株上檢測和評價交聯(lián)度、血清濃度以及細(xì)胞種類對CGN介導(dǎo)的CXCR4 siRNA干擾效率的影響規(guī)律。結(jié)果:(1)制備了五種不同交聯(lián)度的CGN;SEM結(jié)果顯示,CGN為形貌規(guī)整的球形,尺寸均一;隨著交聯(lián)度的增加,CGN的平均粒徑依次為488±103.17、412±67.93、328±68.34、297±64.80、280±72.08 nm;在水溶液中,相應(yīng)的水合粒徑依次為652±10.61、533±2.83、375±7.07、367±7.08、358±3.54nm;Zeta 電位均在+40mV左右,表明CGN表面帶正電。(2)凝膠電泳結(jié)果顯示,當(dāng)CGN與siRNA質(zhì)量比大于4以后,兩者能夠完全結(jié)合。(3)CCK8法檢測結(jié)果表明,CGN對4T1細(xì)胞的毒性作用具有濃度依賴性和尺寸效應(yīng);而GN和CGN@siRNA的細(xì)胞毒性要低于CGN;另外,培養(yǎng)基中血清濃度降低會使CGN@siRNA的細(xì)胞毒性增大。(4)流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示,交聯(lián)度越大,CGN@siRNA進(jìn)入4T1細(xì)胞的能力越強(qiáng);血清濃度越低,越有利于細(xì)胞對CGN@siRNA的攝取;不同種類細(xì)胞對CGN@siRNA的攝取也各不相同。(5)Confocal觀察結(jié)果表明,CGN@siRNA進(jìn)入細(xì)胞后主要分布在溶酶體中。(6)RealtimePCR檢測結(jié)果表明,CGN與CXCR4siRNA復(fù)合物(CGN@siCXCR4)能有效沉默4T1細(xì)胞CXCR4的表達(dá),干擾效率接近商用載體Lipofectamine 3000;沉默效果可持續(xù)96 h,并與CGN交聯(lián)度相關(guān);降低培養(yǎng)基血清濃度有利于增強(qiáng)干擾效率;此外,CGN@siCXCR4在其他不同種類的腫瘤細(xì)胞中的干擾效果不同。結(jié)論:剛離子化明膠微球可在多種腫瘤細(xì)胞株上有效介導(dǎo)CXCR4的RNA干擾,并且基因沉默時間長,可實現(xiàn)siRNA的緩釋,是一種很有潛力用于抗腫瘤治療的siRNA遞送載體。目的:納米銀(AgNPs)優(yōu)越的抗菌性吸引了人們對食品、農(nóng)業(yè)、家用電器、紡織用品、醫(yī)療器械和環(huán)境保護(hù)等多領(lǐng)域產(chǎn)品的研發(fā)興趣。但是隨著在日常生活中的廣泛暴露,納米銀帶來的安全、環(huán)境和健康等問題也引起了學(xué)術(shù)界和相關(guān)監(jiān)管部門的密切關(guān)注。研究顯示,納米銀通過靜脈注射、口服、吸入等暴露途徑進(jìn)入生物體后,在心、肝、脾、肺、腎、腦、睪丸等器官中都有分布,主要通過作用于生物膜、誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS、損傷核內(nèi)DNA以及釋放Ag+等途徑抑制細(xì)胞生長或殺死細(xì)胞,由此導(dǎo)致全身毒性。目前關(guān)于納米銀對血管內(nèi)皮作用的研究主要集中在細(xì)胞毒性方面,關(guān)于其對血管內(nèi)皮細(xì)胞間相互連接的影響以及與銀離子細(xì)胞毒性機(jī)制的差異目前還不完全清楚。本課題在原代人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞上探究納米銀和硝酸銀對血管內(nèi)皮連接的影響以及兩者產(chǎn)生細(xì)胞毒性的機(jī)制差異,并采用尾靜脈暴露方式觀察小鼠血管外周組織的病理改變,驗證兩者對血管內(nèi)皮完整性的影響及其所引起的全身毒性。方法:本研究選用三種不同尺寸AgNPs(10、75、110nm),初始濃度為1mg/mL,表面由2mM檸檬酸鈉包被,設(shè)AgNO3作為對照。在材料表征方面,采用透射電鏡(TEM)觀察AgNPs的形貌和尺寸分布;通過動態(tài)光散射(DLS)檢測AgNPs的水合粒徑和Zeta電位。在細(xì)胞實驗中,將原代人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)作為研究對象,通過CCK8法檢測AgNPs和AgNO3對細(xì)胞活性的影響;利用Hoechst/PI雙熒光染色法觀察兩者引起的細(xì)胞凋亡和壞死情況;使用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)檢測HUVEC細(xì)胞內(nèi)銀元素含量,評價AgNPs和AgNO3的細(xì)胞攝取情況。采用TEM和能譜色散儀(EDX)對AgNPs在細(xì)胞內(nèi)的定位進(jìn)行分析。通過激光共聚焦掃描電鏡(confocal)觀察AgNPs或AgNO3作用后細(xì)胞的鈣粘蛋白(VE-cadherin)和肌動蛋白(Actin)表達(dá)水平,探究兩者對內(nèi)皮細(xì)胞間連接和細(xì)胞骨架的影響。通過流式細(xì)胞檢測儀和熒光顯微鏡檢測DCF的熒光強(qiáng)度,評價兩者引起的胞內(nèi)ROS水平改變。在體內(nèi)驗證實驗中,通過多次尾靜脈注射AgNPs或者AgNO3到小鼠體內(nèi),收集小鼠肝臟、腎臟和肺組織,利用顯微鏡觀察AgNPs引起的病理改變情況;通過TEM觀察AgNPs在肝臟、腎臟和肺中的分布。結(jié)果:(1)理化表征結(jié)果顯示,三種尺寸的AgNPs均呈顆粒狀分布,尺寸均一;粒徑大小為11 ± 1、76± 6和107± 8 nm。在水溶液中的水合粒徑分別為9.8 ± 3.2、72.0 ± 0.9、99.3±1.7nm;在 5%葡萄糖溶液中分別為 10.7±3.3、78.9±0.9、116.8±2.6nm;在完全培養(yǎng)基中靜置至48 h后,粒徑分別為12.6 ±3.9、104.6 ±0.2、147.0 ±1.7 nm,說明AgNPs能穩(wěn)定的分散在水溶液、5%葡糖糖以及完全培養(yǎng)基中。在水溶液中的Zeta電位依次為-42.3±1.4、-45.5±0.7、-44.5±0.4mV;在 5%葡萄糖中依次為-35.7±0.1、-38.2± 1.1、-37.7 ±0.6 mV;在完全培養(yǎng)基中靜置 48 h 后依次為-7.9 ±0.5、-8.0 ±1.1、-7.2 ±1.0 mV,說明AgNPs表面均帶負(fù)電。(2)AgNPs的細(xì)胞毒性具有濃度依賴性和尺寸效應(yīng),主要引起細(xì)胞凋亡;AgNO3的毒性作用明顯強(qiáng)于AgNPs,主要引起細(xì)胞壞死。(3)AgNPs能夠被HUVEC細(xì)胞大量攝取并且分布在溶酶體中;而AgNO3不能被細(xì)胞攝取。(4)AgNPs作用于HUVEC細(xì)胞后使胞內(nèi)ROS水平顯著升高,能減少內(nèi)皮細(xì)胞間連接并且破壞細(xì)胞骨架完整性;AgNO3沒有引起上述現(xiàn)象。(5)抗氧化劑NAC提前處理細(xì)胞能降低AgNPs引起的胞內(nèi)ROS升高水平,削弱AgNPs異致的內(nèi)皮細(xì)胞間連接減少現(xiàn)象,降低AgNPs對內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的毒性作用。(6)多次尾靜脈注射AgNPs引起小鼠肝臟、腎臟和肺組織中血管周圍炎癥細(xì)胞聚集,產(chǎn)生明顯血管周炎癥反應(yīng),而AgNO3沒有這種現(xiàn)象。尾靜脈注射AgNPs主要分布在肝臟組組織中。結(jié)論:AgNPs能夠被血管內(nèi)皮細(xì)胞大量攝取,引起細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高,使血管內(nèi)皮細(xì)胞間連接減少,導(dǎo)致內(nèi)皮泄露,進(jìn)而招募周圍炎癥細(xì)胞在血管周圍聚集,引起了小鼠肝臟、腎臟和肺組織中明顯的血管周圍炎癥反應(yīng)。與此相反,AgNO3沒有被內(nèi)皮細(xì)胞大量攝取,主要通過介導(dǎo)細(xì)胞壞死產(chǎn)生細(xì)胞毒性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R318.08;TB383.1

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本文編號：1615372