本文關(guān)鍵詞： 水產(chǎn)品 單克隆抗體 ELISA 膠體金試紙條　出處：《江南大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：近年來,水產(chǎn)品安全事件頻出,嚴(yán)重影響我國水產(chǎn)品出口貿(mào)易及消費(fèi)者健康。隨著各部門對藥物殘留的監(jiān)管力度加大,對相關(guān)檢測技術(shù)要求也更高。高靈敏、高通量、快速簡便是今后檢測技術(shù)發(fā)展的趨勢。本研究以水產(chǎn)品中藥物殘留較為嚴(yán)重的喹諾酮類抗生素、喹惡啉類促生長劑和亞甲基藍(lán)消毒劑三類危害因子為研究對象,以抗原設(shè)計為切入點(diǎn),制備高靈敏的單克隆抗體并建立相應(yīng)的免疫快速檢測技術(shù)。(1)本研究設(shè)計并合成了10種喹諾酮類半抗原及相應(yīng)的完全抗原,通過免疫小鼠,抗血清篩選階段,確征了效果較好的免疫原,經(jīng)細(xì)胞融合和抗體制備過程,獲得了3種具有不同識別能力的喹諾酮類單克隆抗體,通過異源包被篩選,確定了最佳抗原抗體組合,提高了方法靈敏度,并建立了相應(yīng)的間接競爭ELISA法。其中抗體1C9,對應(yīng)免疫原為諾氟沙星氨基衍生物-KLH(NOR-NH2-KLH),包被原為帕珠沙星-OVA(PAZ-GA-OVA),針對NOR的ELISA方法其IC50為0.12 ng/m L,線性范圍為0.05-0.25ng/m L,交叉反應(yīng)大于10%的喹諾酮藥物為20種�？贵w1E5,對應(yīng)免疫原為那氟沙星氨基衍生物-KLH(NAD-NH2-KLH),包被原為PAZ-GA-OVA,對應(yīng)的針對NAD的ELISA方法其IC50為0.19 ng/m L,線性范圍為0.05-0.74 ng/m L,交叉反應(yīng)大于10%的喹諾酮藥物為14種�？贵w3E4,對應(yīng)免疫原為沙拉沙星羧基衍生物-KLH和諾氟沙星羧基衍生物-KLH(SAR-COOH-KLH和NOR-COOH-KLH)的混合免疫原,包被原為SAR-OVA,對應(yīng)的針對SAR的ELISA方法其IC50為0.52 ng/m L,線性范圍為0.09-2.94 ng/m L,交叉反應(yīng)大于10%的喹諾酮藥物為21種。(2)建立了基于單克隆抗體3E4的可同時檢測32種喹諾酮類藥物的膠體金層析試紙條。金標(biāo)抗體的最佳p H和最佳標(biāo)記量為1 m L膠體金溶液6μL 0.1 mol/L K2CO3溶液,40μL 0.2 mg/m L抗體,檢測抗原濃度為0.5 mg/m L。其比色法的消線值在1-100 ng/m L之間,檢測限在0.25-10 ng/m L之間,可以滿足牛奶中喹諾酮類藥物的限量要求,適用于現(xiàn)場快速檢測。(3)合成了喹乙醇半抗原OLA-HS,并成功篩到了通用型的喹惡啉類單克隆抗體,利用通用型抗體2F3建立了魚飼料中喹惡啉類藥物的間接競爭ELISA方法。其最佳工作條件為:選用喹乙醇代謝物MQCA的氨基己酸衍生物偶聯(lián)蛋白(MQCA-ACA-OVA)作異源包被原,包被濃度為0.3μg/m L,抗體2F3濃度為0.11μg/m L,標(biāo)品溶液為Na Cl濃度為1.6%,p H為8.2的硼酸鹽緩沖溶液。在最佳工作條件下,IC50為1.03 ng/m L,線性范圍為0.05-0.25 ng/m L,相關(guān)系數(shù)為0.997,對乙酰甲喹,喹烯酮和卡巴氧的交叉分別為67%,60%和0.9%。對魚飼料樣品進(jìn)行了添加回收實(shí)驗(yàn),ELISA的回收率在82.1%-96.3%。(4)設(shè)計并合成了5種MQCA半抗原,分別暴露出分子結(jié)構(gòu)的兩端作抗原決定簇,制備了能夠特異性識別MQCA的單克隆抗體,并建立了魚肉中MQCA殘留的間接競爭ELISA方法。通過異源包被篩選,得到最佳的抗原抗體組合。所制備的抗體1A11,對應(yīng)免疫原為MQCA-(NH2)4-KLH,包被原為MQCA-NH2-OVA,在最佳工作條件(包被濃度0.03μg/m L和抗體濃度為0.3μg/m L,標(biāo)品稀釋液為Na Cl濃度為1.6%,p H為7.4的PBS溶液)下,IC50為3.17 ng/m L,線性范圍為0.58-17.29 ng/m L,平均回收率在81.6%-90.7%之間,變異系數(shù)在3.95%-7.1%之間,適用于魚肉中MQCA的殘留檢測。(5)建立了基于單克隆抗體1A11的MQCA膠體金層析試紙條,金標(biāo)抗體的最佳p H和最佳標(biāo)記量為1 m L膠體金溶液4μL 0.1 mol/L K2CO3溶液,50μL 0.2 mg/m L抗體,檢測抗原濃度為0.5 mg/m L。其比色法的消線值為5 ng/m L,檢測限在0.25 ng/m L,適用于魚肉中MQCA殘留的現(xiàn)場快速檢測。(6)設(shè)計并合成了新型亞甲基藍(lán)半抗原,制備了能夠特異性識別亞甲基藍(lán)的單克隆抗體,利用所制備的抗體1H4建立了魚肉中亞甲基藍(lán)殘留檢測的間接競爭ELISA方法。最佳工作條件為包被濃度0.1μg/m L和抗體濃度為0.1μg/m L,標(biāo)品稀釋液為Na Cl濃度為1.6%,p H為7.4的PBS溶液,IC50為21.13 ng/m L,線性范圍為4.26-104.83 ng/m L.對魚肉樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn),回收率為82.1%-90.1%,適用于實(shí)際樣品檢測。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：TS254.7

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本文編號：1512707