本文關(guān)鍵詞： rCHO細(xì)胞 單克隆抗體 電荷異質(zhì)性 賴氨酸變體 培養(yǎng)溫度 金屬離子 堿性氨基酸　出處：《華東理工大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：近年來抗體藥物市場高速增長,應(yīng)用動物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)高效生產(chǎn)抗體藥物已成為了當(dāng)今生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的核心技術(shù)。作為一類糖蛋白,抗體藥物在生產(chǎn)過程中會發(fā)生一系列的翻譯后修飾和降解,從而導(dǎo)致其異質(zhì)性的出現(xiàn)。電荷異質(zhì)性是抗體藥物的一項關(guān)鍵質(zhì)量屬性,在抗體藥物的有效性和安全性等臨床特性方面發(fā)揮著重要的作用。然而,由于缺乏對電荷異質(zhì)性這一關(guān)鍵質(zhì)量屬性及其與細(xì)胞培養(yǎng)過程關(guān)系的認(rèn)識,抗體藥物電荷異質(zhì)性的有效控制仍是當(dāng)今抗體藥物開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化面臨的難題。正確認(rèn)識和理解抗體藥物的臨床特性、質(zhì)量屬性和細(xì)胞培養(yǎng)過程三者之間的關(guān)系,尤其是電荷變體的生成及其與細(xì)胞培養(yǎng)過程之間的關(guān)系,對科學(xué)指導(dǎo)建立高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定的抗體藥物生產(chǎn)過程具有十分重要的意義。為此,本文以表達(dá)抗CD20單克隆抗體的重組rCHO細(xì)胞為研究對象,首先通過質(zhì)量分析方法對抗體電荷異質(zhì)性的基本特征進(jìn)行考察和了解,在此基礎(chǔ)上,通過無細(xì)胞冷模實驗和動力學(xué)模型的建立,分析和認(rèn)識細(xì)胞培養(yǎng)過程中抗體酸性電荷變體以及堿性電荷變體(賴氨酸變體)的生成過程,同時考察培養(yǎng)溫度以及培養(yǎng)基組分等培養(yǎng)工藝參數(shù)對抗體電荷異質(zhì)性的影響,為后續(xù)rCHO細(xì)胞高效培養(yǎng)過程的建立以及抗體藥物電荷異質(zhì)性的有效控制奠定基礎(chǔ)。本文首先考察了前期建立的rCHO細(xì)胞流加培養(yǎng)過程,認(rèn)識了細(xì)胞生長、抗體合成以及抗體電荷分布等基本表現(xiàn)。結(jié)果表明,培養(yǎng)過程中最大活細(xì)胞密度達(dá)到10.5×106cells/ml,最終抗體濃度達(dá)到3181mg/L,抗體的平均比生產(chǎn)速率為28.21mg/109cells/day。然而,弱陽離子交換色譜WCX檢測結(jié)果表明,該工藝過程生產(chǎn)的抗體中含有較高的酸性和堿性電荷變體,至培養(yǎng)結(jié)束時兩者分別達(dá)到了 27.7%和34.9%。為了考察抗體電荷變體的生成位置、來源及其對生物學(xué)功能的影響等基本特征,本文首先使用木瓜蛋白酶酶切的方法確定抗體電荷變體的生成位置,結(jié)果表明導(dǎo)致抗體電荷變體生成的后修飾或降解位點同時位于抗體的Fab片段和Fc片段。其次使用WCX對抗體的各電荷變體組分(包括酸性組分、堿性組分以及主峰)進(jìn)行了成功的分離和收集,并檢測了各電荷變體組分的聚體含量、還原型片段含量、糖型結(jié)構(gòu)、抗原抗體結(jié)合能力以及CDC生物學(xué)活性。結(jié)果表明,抗體酸性組分中聚體含量、還原型片段含量以及唾液酸化的糖型含量均顯著高于堿性組分,說明聚體、還原型片段以及唾液酸都是抗體酸性電荷變體的重要來源。此外,抗體酸性和堿性電荷變體的生成均導(dǎo)致其抗原結(jié)合能力和CDC生物學(xué)活性的大幅下降。由此可見,電荷異質(zhì)性是抗體的一項關(guān)鍵質(zhì)量屬性,有必要對它的生成過程及其與細(xì)胞培養(yǎng)過程的關(guān)系進(jìn)行深入的研究。針對本文rCHO細(xì)胞培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的高含量酸性電荷變體,首先通過無細(xì)胞冷模實驗和動力學(xué)模型的分析計算,深入認(rèn)識了細(xì)胞培養(yǎng)過程中抗體酸性電荷變體的生成過程。實驗結(jié)果表明,細(xì)胞培養(yǎng)過程中抗體酸性電荷變體的生成同時發(fā)生于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外,涉及胞內(nèi)和胞外兩個過程。其中,胞外部分抗體酸性電荷變體的生成是一個自發(fā)進(jìn)行的非酶促過程,受培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基組成等因素的影響,降低培養(yǎng)溫度可在一定程度上減緩胞外抗體酸性電荷變體的生成。動力學(xué)研究結(jié)果表明,胞外部分抗體酸性電荷變體的生成過程符合一級反應(yīng)動力學(xué)規(guī)律和阿侖尼烏斯方程,而且抗體分子中天冬酰胺的去酰胺化反應(yīng)有可能是導(dǎo)致胞外抗體酸性電荷變體生成的主要原因。此外,建立了抗體酸性電荷變體生成的動力學(xué)模型。通過動力學(xué)模型的計算和分析,發(fā)現(xiàn)胞外部分生成的抗體酸性電荷變體在整個抗體酸性電荷變體中占主導(dǎo)地位(占了 74.9%)。同時,當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)過程進(jìn)入后期,細(xì)胞分泌的抗體中所含酸性電荷變體的含量(Qa值)也迅速上升,進(jìn)一步的研究表明,Qa值的上升與分泌抗體中片段以及聚體含量的上升密切相關(guān)。溫度的降低可以有效減少胞外部分抗體酸性電荷變體的生成,為此本文進(jìn)一步通過考察培養(yǎng)溫度這一關(guān)鍵過程參數(shù)對rCHO細(xì)胞生長、抗體合成以及抗體電荷分布的影響,發(fā)現(xiàn)降低培養(yǎng)溫度對rCHO細(xì)胞的生長和活性維持均無顯著影響,但卻不利于抗體的合成,同時影響抗體的電荷分布。當(dāng)培養(yǎng)溫度從37℃下降到32℃時,最終的抗體濃度從3532 mg/L下降到了 2436mg/L,同時抗體的比生產(chǎn)速率從29.15mg/109cells/day下降到了 12.29 mg/109cells/day。在抗體電荷分布方面,降溫雖然降低了抗體的酸性電荷變體含量,但同時提高了堿性電荷變體含量,兩者相抵后對抗體的主峰含量無顯著貢獻(xiàn)。當(dāng)培養(yǎng)溫度從37℃下降到32℃時,抗體酸性電荷變體含量下降了 9個百分點,但堿性電荷變體含量提高了 7個百分點。此外,降溫時間的調(diào)整同樣影響了 rCHO細(xì)胞抗體的合成以及抗體的電荷分布。降溫時間越早,最終的抗體濃度也就越低,第4天降溫獲得的抗體濃度僅為第10天降溫的66.2%。推遲降溫時間,使得抗體的酸性電荷變體含量升高,而堿性電荷變體含量降低,最終獲得的抗體主峰含量基本保持不變。當(dāng)降溫時間從第4天推遲到第10天時,抗體的酸性電荷變體和堿性電荷變體含量分別上升和下降了 4個百分點。針對rCHO細(xì)胞培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的高含量堿性電荷變體,首先通過堿性羧肽酶酶切的方法檢測了抗體的賴氨酸變體含量,結(jié)果表明高含量的賴氨酸變體是導(dǎo)致抗體堿性電荷變體含量升高的主要原因。培養(yǎng)結(jié)束時,抗體的賴氨酸變體含量高達(dá)16.8%,占了所有堿性電荷變體的一半左右。因此,降低賴氨酸變體含量是控制抗體堿性電荷變體的有效手段。通過考察培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基中的金屬離子(銅離子和鋅離子)以及堿性氨基酸(精氨酸和賴氨酸)等培養(yǎng)工藝參數(shù)對抗體C末端賴氨酸酶切過程以及賴氨酸變體含量的影響,發(fā)現(xiàn)降低培養(yǎng)溫度能夠顯著提高抗體中的賴氨酸變體含量。RT-PCR檢測結(jié)果表明,CpB和CpH是rCHO細(xì)胞中負(fù)責(zé)催化抗體C末端賴氨酸酶切過程的兩種堿性羧肽酶。降溫顯著降低了 CpB的表達(dá),從而影響了抗體C末端賴氨酸的酶切過程以及賴氨酸變體的含量。培養(yǎng)基中的銅離子和鋅離子在rCHO細(xì)胞的生長、抗體合成以及電荷分布等方面都發(fā)揮著重要的作用。在抗體電荷分布方面,銅離子和鋅離子作為堿性羧肽酶的抑制劑和輔因子,對堿性羧肽酶的活性分別具有抑制和激活作用,因此會顯著影響抗體C末端的賴氨酸酶切過程,通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中銅、鋅離子的濃度及其比例可以有效控制抗體的賴氨酸變體含量。此外,培養(yǎng)基中高濃度的堿性氨基酸(精氨酸和賴氨酸)同樣會引起抗體賴氨酸變體含量的升高。實驗結(jié)果表明,胞內(nèi)外堿性氨基酸的濃度與其作為產(chǎn)物的抑制常數(shù)Ki值十分接近,說明培養(yǎng)基中的高濃度堿性氨基酸有可能存在對堿性羧肽酶的產(chǎn)物抑制效應(yīng),從而導(dǎo)致抗體賴氨酸變體含量的提高。無細(xì)胞冷模實驗結(jié)果在一定程度上驗證了這種產(chǎn)物抑制效應(yīng)的存在。最后,本文通過無細(xì)胞冷模實驗以及動力學(xué)模型的計算分析,進(jìn)一步認(rèn)識了細(xì)胞培養(yǎng)過程中抗體C末端的賴氨酸酶切過程。實驗結(jié)果表明,抗體C末端的賴氨酸酶切過程也由胞內(nèi)和胞外兩部分組成,其中胞外酶切過程符合一級反應(yīng)動力學(xué)規(guī)律,并且隨著培養(yǎng)過程的進(jìn)行,其反應(yīng)速率常數(shù)k值以及酶切速率都逐漸提高,而胞內(nèi)部分的酶切速率在細(xì)胞培養(yǎng)后期則有所下降。此外,動力學(xué)模型的計算結(jié)果表明胞內(nèi)部分在整個抗體C末端的賴氨酸酶切過程中占主導(dǎo)地位(占了 93.6%)。通過本文的研究,深入認(rèn)識了細(xì)胞培養(yǎng)過程中抗體電荷變體的生成過程,豐富了人們對抗體電荷變體與細(xì)胞培養(yǎng)過程之間關(guān)系的認(rèn)識,為rCHO細(xì)胞高效培養(yǎng)過程的建立和抗體電荷異質(zhì)性的有效控制奠定了基礎(chǔ)。
[Abstract]:In order to understand and understand the relationship between cell growth , antibody synthesis and antibody charge distribution , it is very important to understand and understand the relationship between cell growth , antibody synthesis and antibody charge distribution . The results show that the generation of acidic charge variants of the extracellular part is a spontaneous non - enzymatic process , which can reduce the formation of acidic charge variants of extracellular antibodies . At the end of culture , the content of acid charge of the antibody was decreased by 9 percentage points , but the content of the antibody was decreased by 7 percentage points . The results showed that the enzyme - cutting process of the antibody C - terminal was consistent with the kinetics of the first - order reaction , and the enzyme - cutting rate of the intracellular part decreased after the cell culture . The results of the kinetic model showed that the intracellular part was dominant in the process of lysine enzyme digestion at the end of the whole antibody ( 93.6 % ) . Through the research in this paper , the formation process of antibody charge variants in cell culture is deeply recognized , and the understanding of the relationship between antibody charge variants and cell culture processes is enriched , which lays the foundation for the establishment of efficient culture process of rCHO cells and the effective control of antibody charge heterogeneity .

【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：TQ460.1

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本文編號：1476256