本文關(guān)鍵詞：基于蛋白質(zhì)組學(xué)的宰后牦牛肉保水性機(jī)制研究　出處：《甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：牦牛肉營養(yǎng)豐富,但保水性較低,影響了食用加工品質(zhì)。因此,控制宰后汁液損失,減少經(jīng)濟(jì)損失是牦牛肉加工產(chǎn)業(yè)中亟待解決的重要問題。目前研究認(rèn)為,蛋白質(zhì)的變化影響宰后肌肉保水性,但是由于蛋白質(zhì)組成的復(fù)雜性,其機(jī)理尚不完全明晰。因此,結(jié)合多種分析測(cè)試手段,探索宰后牦牛肉保水性變化機(jī)理具有重要意義。本文以牦牛背最長肌為主要研究對(duì)象,以黃牛作為對(duì)照,利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)手段探究了宰后成熟過程中滴水損失、蒸煮損失的變化規(guī)律,明確了代謝酶、結(jié)構(gòu)蛋白和應(yīng)激蛋白與肌肉保水性的關(guān)系。并以此為理論依據(jù),利用生物信息學(xué)分析揭示了牦牛肉中蛋白質(zhì)影響保水性的代謝通路,以期闡明牦牛肉中保水性形成的途徑及原因。主要研究結(jié)果如下:1.確定了牦牛肉不同保水性組的品質(zhì)指標(biāo),并進(jìn)行了相關(guān)性分析。以滴水損失、蒸煮損失為變量對(duì)32頭牦牛進(jìn)行了聚類分析。根據(jù)歐式距離5,32個(gè)樣品被分為高保水性組(n=12,1.91%≤滴水損失≤2.59%,29.91%≤蒸煮損失≤32.80%)和低保水性組(n=12,3.73%≤滴水損失≤4.01%,34.55%≤蒸煮損失≤39.72%)。高保水性組樣品與低保水組樣品相比,其pH、a*值、彈性、咀嚼性、總蛋白溶解性、肌漿蛋白溶解性、肌漿蛋白溶解性高,肌節(jié)長度長。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,保水性相關(guān)品質(zhì)指標(biāo)具有很強(qiáng)的相關(guān)性,pH的降低造成蛋白質(zhì)的變性,包括結(jié)構(gòu)蛋白和呈色蛋白,呈色蛋白中最重要的肌紅蛋白氧化成高鐵肌紅蛋白,造成a*的下降,b*的升高。因此,造成牦牛肉保水性降低的原因可能歸結(jié)于pH值的下降、蛋白質(zhì)變性和肌纖維結(jié)構(gòu)的變化。2.確定了牦牛背最長肌雙向電泳的最優(yōu)條件。通過多重條件的對(duì)比,適合牦牛肉背最長肌的雙向電泳條件是:裂解液II法進(jìn)行牦牛肌肉全蛋白提取、漸進(jìn)式快速升壓程序和改良的考染法染色。在該最優(yōu)條件下獲得的蛋白點(diǎn)匹配率高,得到分辨率高,背景清晰的圖像。3.明確了牦牛肉中影響滴水損失的差異蛋白質(zhì),并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。利用質(zhì)譜分析技術(shù)對(duì)高滴水損失(HDrip)組和低滴水損失(LDrip)組中的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定,篩選出55種差異表達(dá)蛋白。所得到的蛋白分為五類,分別是代謝酶、結(jié)構(gòu)蛋白、應(yīng)激蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及其他類蛋白質(zhì)。對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行層次聚類分析,結(jié)果顯示,在宰后第0、1、7d,分別有24、30、20個(gè)蛋白的豐度上調(diào)(LDrip組高于HDrip組);7、11、11個(gè)蛋白點(diǎn)豐度下調(diào)(LDrip組低于HDrip組)。進(jìn)而對(duì)發(fā)生顯著性變化的差異表達(dá)蛋白質(zhì)磷酸丙糖異構(gòu)酶(TIM)、肌球蛋白輕鏈(MLC)、熱休克蛋白27(HSP27)進(jìn)行了免疫印跡驗(yàn)證,結(jié)果顯示,三種蛋白質(zhì)在LDrip組中灰度值均高于HDrip組,且宰后成熟過程中,免疫印跡灰度值均呈現(xiàn)下降趨勢(shì),與雙向電泳結(jié)果呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)。GO分析結(jié)果顯示,55種蛋白質(zhì)主要富集在細(xì)胞(cell)、細(xì)胞器(organelle)和胞外組分(extracellular region)中;差異蛋白質(zhì)主要起連接(binding)、催化活性(catalytic activity)和結(jié)構(gòu)分子(structural molecule activity)作用;差異蛋白參與的生物過程主要在組織過程(single-organism process)、細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程(cellular process)和代謝過程(metabolic process)中。通過蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析,得到影響牦牛肉滴水損失的核心蛋白,基因名稱分別是TPI1(TIM),PKM(丙酮酸激酶),LDHA(L-乳酸脫氫酶A鏈),ENO3(β-烯醇化酶),NDUFB1(NADH脫氫酶),ATP5A1(ATP合酶),HSPB27(熱休克蛋白27),MYL(肌球蛋白輕鏈),TNNI1(肌鈣蛋白I)和DES(Desmin)。差異表達(dá)蛋白質(zhì)可以歸納為兩類,一類是與糖酵解途徑和能量代謝相關(guān)的酶,另一類是與細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)。4.明確了牦牛肉中影響蒸煮損失的差異蛋白質(zhì),并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。利用質(zhì)譜分析技術(shù)對(duì)高蒸煮損失(HCL)組和低蒸煮損失(LCL)組中的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定,篩選出26種差異表達(dá)蛋白。所得到的蛋白分為四類,分別是代謝酶、結(jié)構(gòu)蛋白、應(yīng)激蛋白及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。對(duì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行層次聚類分析,結(jié)果顯示,有14種蛋白質(zhì)的豐度在HCL組中高于LCL組,有12種蛋白質(zhì)的豐度在HCL組中低于LCL組。進(jìn)而對(duì)發(fā)生顯著性變化的差異表達(dá)蛋白質(zhì)肌間線蛋白(Desmin)、肌鈣蛋白T(TnT)、乳酸脫氫酶(LDH)進(jìn)行了免疫印跡驗(yàn)證,結(jié)果顯示,Desmin和TnT在高、低蒸煮損失組中趨勢(shì)與雙向電泳結(jié)果相同,LDH在兩組間變化趨勢(shì)與雙向電泳結(jié)果相似。GO分析結(jié)果顯示,26種蛋白質(zhì)主要富集在細(xì)胞(cell)、細(xì)胞器(organelle)和細(xì)胞膜(membrane)中;差異蛋白質(zhì)主要起連接(binding)、催化活性(catalytic activity)和結(jié)構(gòu)分子(structural molecule activity)作用;差異蛋白參與的生物過程主要在組織過程(single-organism process)、細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程(cellular process)和代謝過程(metabolic process)中。通過蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析,差異表達(dá)蛋白質(zhì)可以歸納為兩類,一類是與糖酵解途徑和能量代謝相關(guān)的酶,另一類是與細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)。與蛋白質(zhì)組分析一致,LDH、TnT和Desmin是蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵蛋白。5.明確了牦牛與黃牛肌肉的差異蛋白質(zhì)組,并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。利用質(zhì)譜分析技術(shù)對(duì)檢測(cè)到的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定,篩選出19種不同的差異表達(dá)蛋白。結(jié)果表明,造成牦牛、黃牛不同物種間肌肉生物學(xué)特性差異的主要蛋白質(zhì)包括代謝酶、結(jié)構(gòu)蛋白和應(yīng)激蛋白,這些蛋白質(zhì)主要涉及到的代謝通路包括細(xì)胞能量代謝、碳水化合物代謝、遺傳物質(zhì)信號(hào)通路、蛋白質(zhì)合成與分解過程,涉及這些代謝通路的生理生化反應(yīng)最終造成了牦牛、黃牛保水性的差異。其中,細(xì)胞代謝(38%)、碳水化合物代謝(31%)和能量代謝(8%)相關(guān)的蛋白質(zhì)在代謝通路分類中約占77%,確定了蛋白質(zhì)代謝過程在牦牛、黃牛肉質(zhì)形成過程中的重要性。6.通過維恩圖法對(duì)不同滴水損失牦牛肉、不同蒸煮損失牦牛肉、黃牛對(duì)照組進(jìn)行分析,得出影響牦牛保水性的12種蛋白質(zhì),分別是LDH、CKM、β-烯醇化酶、腺苷酸激酶、丙酮酸激酶、二氫硫辛酸脫氫酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、Desmin、肌鈣蛋白I、肌鈣蛋白T、MLC和HSP27。在Ex PASy服務(wù)器中使用Protparam工具對(duì)經(jīng)過免疫印跡驗(yàn)證分析的LDH、TIM、MLC、TnT、Desmin和HSP27 6個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行了蛋白質(zhì)疏水性分析,結(jié)果顯示LDH、TIM、TnT和HSP27蛋白中的疏水性區(qū)域較廣,疏水性得分較高。即表明,氨基酸的高疏水性可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)和水之間的排斥,這可能是導(dǎo)致牦牛肉中保水性較弱的原因之一。使用Wolf PSORT軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。差異表達(dá)的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中分為8個(gè)位置,差異蛋白質(zhì)大多位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和線粒體中。7.闡明了宰后牦牛肉中影響保水性的三種不同途徑。第一種途徑為:牦牛為適應(yīng)高原環(huán)境而產(chǎn)生高原習(xí)服現(xiàn)象,通過增加糖酵解來支持和維持ATP的產(chǎn)生。牦牛肉中糖酵解酶強(qiáng)度增加,引起宰后牦牛肉中pH下降,肌肉內(nèi)靜電荷減少,引起牦牛肉中保水性降低。第二種途徑為:蛋白質(zhì)的降解和變性作用使肌原纖維緊縮,能潴留不易流動(dòng)水的空間變小,同時(shí),結(jié)構(gòu)蛋白形成疏水鍵,使牦牛肌肉內(nèi)保水性降低。第三種途徑為:應(yīng)激蛋白通過維持肌原纖維蛋白的穩(wěn)定、防止微絲等細(xì)胞骨架蛋白降解,調(diào)節(jié)維持宰后肌肉中保水性平衡,HSP27蛋白變化較為明顯。綜上可知,本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法,研究牦牛肉宰后成熟過程中蛋白質(zhì)變化規(guī)律,并以黃牛作為對(duì)照,找到了影響牦牛保水性的12種關(guān)鍵蛋白質(zhì),闡明了宰后牦牛肉中影響保水性的三種不同途徑。從蛋白質(zhì)分子、肌肉細(xì)胞、肌肉保水性不同層面,深入闡明宰后成熟過程中牦牛肉的保水性機(jī)制,為解釋牦牛肌肉生物學(xué)特性和肉品質(zhì)差異提供有意義的理論依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：TS251.52

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本文編號(hào)：1420320