本文關(guān)鍵詞：Cytophaga hutchinsonii β-葡萄糖苷酸及flexirubin色素的功能研究　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：隨著工業(yè)的發(fā)展和人口的增加,資源短缺和環(huán)境污染成為困擾人類發(fā)展的兩個(gè)重要難題。進(jìn)入新世紀(jì)以來化石資源日益枯竭,開發(fā)清潔的的可再生能源已成為人們的迫切需要。以纖維素為主要成分的生物質(zhì)資源是地球上含量最豐富的可再生資源,對(duì)纖維素資源的開發(fā)利用越來越受到人們的重視。但由于纖維素結(jié)構(gòu)致密、不溶于水、本身存在結(jié)晶區(qū)等原因,纖維素的生物轉(zhuǎn)化效率很低。因此研究纖維素的生物降解途徑,提高生物轉(zhuǎn)化的效率是纖維素資源利用的前提條件。Cytophaga hutchinsonii是擬桿菌門(Bacteroidetes)一種好氧的革蘭氏陰性細(xì)菌。C.hutchinsonii 可以快速徹底地降解結(jié)晶纖維素,但其既不分泌游離的纖維素酶也沒有纖維小體結(jié)構(gòu),同時(shí)纖維素酶系中沒有內(nèi)切纖維素酶存在,纖維素酶也不含有CBM結(jié)構(gòu)。因此C.hutchinsonii的纖維素降解機(jī)制不同于已知的好氧微生物游離纖維素酶機(jī)制以及厭氧微生物的纖維小體降解機(jī)制,可能是一種全新且未知的降解機(jī)制。對(duì)這種高效的結(jié)晶纖維素降解機(jī)制的研究有助于提高人們對(duì)纖維素降解機(jī)制的認(rèn)識(shí),并對(duì)纖維素生物轉(zhuǎn)化利用提供幫助。之前由于C.hutchinsonii遺傳操作體系的不成熟,對(duì)其纖維素降解機(jī)制研究進(jìn)展十分緩慢。近年來C.hutchinsonii遺傳操作體系的不斷發(fā)展為纖維素降解機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。纖維二糖是纖維素的結(jié)構(gòu)的基本組成單位,并且纖維二糖還是纖維素降解的重要中間產(chǎn)物。因此探究C.hutchinsonii對(duì)纖維二糖的降解及利用過程對(duì)C.hutchinsonii纖維素降解機(jī)制的研究有重要意義。本文通過基因敲除等手段探究C.hutchinsonii的四個(gè)β-葡葡糖苷酶各自的功能及其在纖維素降解中作用。同時(shí)利用離子色譜手段對(duì)纖維寡糖和纖維素降解過程的中間產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè),以期望可以探尋C.hutchinsonii纖維素的降解途徑。采用新的吸附蛋白提取方法鑒定出一批C.hutchinsonii的吸附蛋白,研究了纖維素誘導(dǎo)吸附蛋白CHU_0344的功能。同時(shí)利用轉(zhuǎn)座子插入突變方法篩選到一株色素缺失菌株,研究了 flexirubin色素多烯鏈合成中關(guān)鍵β-羥酰-ACP脫水酶的作用以及flexirubin色素的生物學(xué)功能。具體內(nèi)容及結(jié)果如下:1.C.hutchinsonii β-葡萄糖苷酶功能及其對(duì)纖維素降解的影響,C.hutchinsonii纖維素降解產(chǎn)物檢測(cè)及其雙途經(jīng)降解體系。我們研究了C.hutchinsonii β-葡萄糖苷酶的功能,及其在纖維素降解中的作用。同時(shí)首次研究發(fā)現(xiàn)C.hutchinsonii存在細(xì)胞表面纖維素降解途徑,并證實(shí)C.hutchinsonii存在細(xì)胞內(nèi)降解途徑,從而提出新的雙途徑降解模型。β-葡萄糖苷酶在纖維素降解過程中主要起到降解中間產(chǎn)物纖維二糖的作用。同時(shí)有部分β-葡萄糖苷酶具有轉(zhuǎn)糖基作用。C.hutchinsonii經(jīng)過基因組分析預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)有四個(gè)β-葡萄糖苷酶基因:bglA(chu_2268)、bglB(chu_2273)、bglC(chu_3577)和bglD(chu_3784)。所有的四個(gè)β-葡萄糖苷酶都屬于糖苷水解酶GH3家族,其中BglA,BglB,BglC被預(yù)測(cè)為脂蛋白。通過SignalP4.1預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)只有BglB含有信號(hào)肽,但是BglA,BglC和BglD蛋白的前30位氨基酸均含有大量的疏水性氨基酸,因此推測(cè)在這些蛋白中同樣含有信號(hào)肽。為研究四個(gè)β-葡萄糖苷酶在纖維二糖和纖維素降解中各自起的作用,首先檢測(cè)野生菌株中在不同培養(yǎng)條件下四個(gè)酶在RNA水平和蛋白水平的表達(dá)情況。通過熒光定量PCR和蛋白活性電泳檢測(cè),發(fā)現(xiàn)在葡萄糖培養(yǎng)條件下只有bglB基因存在表達(dá)。在纖維二糖或纖維素培養(yǎng)條件下BglA和BglB都存在表達(dá),但BglA的表達(dá)水平遠(yuǎn)低于BglB。BglC的兩種條件下表達(dá)水平都很低,而BglD現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)條件下檢測(cè)不到表達(dá)。因此我們推測(cè)BglA和BglB在C.hutchinsoni 纖維二糖和纖維素降解中期關(guān)鍵作用。隨后我們通過同源雙交換重組技術(shù)對(duì)四個(gè)β3-葡萄糖苷酶進(jìn)行基因敲除,得到單敲除菌株△ bglA、△bglB、和△bglD 同時(shí)對(duì)主要的β-葡萄糖苷酶進(jìn)行多敲除得到△bglA/hglB和△bglA/bglB/bglC突變株。表型檢測(cè)發(fā)現(xiàn)單敲除菌株中有△bglB在纖維二糖和纖維素培養(yǎng)時(shí)存在延遲,其它單敲除菌株不受影響。但雙敲除菌株和三敲除菌株喪失降解纖維二糖和纖維素的能力。酶活檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在葡萄糖培養(yǎng)條件下單獨(dú)敲除bglB后菌體喪失全部β-葡萄糖苷酶酶活,而在纖維素培養(yǎng)條件下敲除bglB后菌體保留20%的酶活,但△ bglA/bglB喪失所有酶活,其它單敲除菌株不會(huì)影響菌體的β-葡萄糖苷酶酶活。同時(shí)檢測(cè)菌體的纖維二糖降解能力,發(fā)現(xiàn)△bglB在降解纖維二糖時(shí)存在延遲并且降解速率明顯降低,△bglA/bglB完全喪失降解纖維二糖的能力。所有結(jié)果表明BglB在C.hutchinsoni 纖維二糖和纖維素降解中起關(guān)鍵作用,BglA可以被誘導(dǎo)產(chǎn)生從而部分彌補(bǔ)△bgl中β-葡萄糖苷酶缺失帶來的影響。在纖維素降解方面,所有單敲除菌株均可以降解纖維素,△bglA/bglB無法在液體條件下降解纖維素,但是在固體平板上可以降解濾紙。通過研究發(fā)現(xiàn)固體平板中的少量營養(yǎng)物質(zhì)可以促使△bglA/bglB 降解纖維素,并且在液體條件下外加少量葡萄糖時(shí)△bglA/bglB 可以降解纖維素。但△bglA/bglB 缺失β-葡萄糖苷酶活性,在外加葡萄糖條件下仍不能降解纖維二糖。這些結(jié)果表明C.hutchinsonii可以通過不需要β-葡萄糖苷酶參與的途徑降解纖維素。經(jīng)過定量分析發(fā)現(xiàn)當(dāng)△ bglAbglB在外加少量葡萄糖條件下降解纖維素時(shí),超過55%的纖維素被轉(zhuǎn)化為纖維二糖,其它部分纖維素被菌體轉(zhuǎn)化為葡萄糖供菌體生長(zhǎng)。我們基于離子色譜的手段建立了C.hutchinsonii 細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)纖維寡糖的檢測(cè)方法。當(dāng)野生菌體與纖維二糖共同孵育時(shí),短時(shí)間內(nèi)菌體即可將纖維二糖完全轉(zhuǎn)化為葡萄糖并在細(xì)胞外大量積累,但在整個(gè)過程中細(xì)胞體內(nèi)檢測(cè)不到纖維二糖和葡萄糖的積累。同時(shí)通過酶活測(cè)定結(jié)果以及Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)C.hutchinsonii中β-葡萄糖苷酶既存在于細(xì)胞表面又存在于周質(zhì)空間。由此我們推斷外源的纖維二糖在細(xì)胞表面降解為葡萄糖后再被菌體利用。長(zhǎng)期以來,人們?cè)贑.hutchinsonii的發(fā)酵液中沒有檢測(cè)到明顯的還原糖。我們通過離子色譜的手段成功的在纖維素培養(yǎng)早期檢測(cè)到明顯的葡萄糖積累。另外當(dāng)野生株菌體與纖維素孵育時(shí),在體外可以檢測(cè)到大量的葡萄糖以及少量的纖維二糖和纖維三糖積累。同時(shí)細(xì)胞表而存在β-葡萄糖苷酶和纖維素內(nèi)切酶,這表明C.hutchinsonii存在細(xì)胞表面纖維素降解途徑。我們首次在C.hutchinsonii降解纖維素過程中,于細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)到大量的葡萄糖、纖維二糖以及纖維二糖等纖維素降解產(chǎn)物的積累。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外纖維寡糖不容易轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞體內(nèi),這表明細(xì)胞內(nèi)降解產(chǎn)物不是由細(xì)胞外降解產(chǎn)物轉(zhuǎn)運(yùn)而來。同時(shí)周質(zhì)空間存在β-葡萄糖苷酶和纖維素內(nèi)切酶,這表明C.hutchinsonii存在細(xì)胞內(nèi)纖維素降解途徑。根據(jù)本文中研究結(jié)果結(jié)合他人的研究成果,我們提出新的C.hutchinsonii纖維素降解模型:1.C.hutchinsonii既可以在細(xì)胞表面降解纖維素也可以在周質(zhì)空間降解纖維素。2.在細(xì)胞表面纖維素內(nèi)切酶在其它蛋白幫助下可以將纖維素降解為纖維寡糖,隨后被β-葡萄糖苷酶降解為葡萄糖。3.細(xì)胞表面的蛋白可以剝離纖維素鏈并將其轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)空間,并通過纖維素內(nèi)切酶和β-葡萄糖苷酶降解為葡萄糖4.C.hutchinsoni 可以在沒有β-葡萄糖苷酶的參與下部分降解纖維素。在這一部分工作中我們研究了 C.hutchinsoniiβ-葡萄糖苷酶的功能,提出新的雙途徑降解模型。這提高了我們對(duì)C.hutchinsonii纖維素降解機(jī)制的認(rèn)識(shí),使C.hutchinsonii纖維素降解研究不再局限于周質(zhì)空間,從而使有利于進(jìn)一步揭示C.hutchinsonii纖維素降解機(jī)制。2.纖維素吸附蛋白的鑒定及吸附蛋白CHU__0344功能的研究C.hutchinsonii獨(dú)特的纖維素降解途徑需要菌體直接與纖維素接觸。纖維素吸附蛋白特別是表面吸附蛋白在菌體吸附并降解纖維素過程中起重要作用。本文通過使用TritonX-100抽提破碎細(xì)胞釋放蛋白質(zhì)并使其吸附纖維素的方法,得到菌體在葡萄糖和纖維素培養(yǎng)條件下的全細(xì)胞的吸附蛋白。經(jīng)過質(zhì)譜鑒定得到781個(gè)纖維素培養(yǎng)條件下的吸附蛋白和744個(gè)葡萄糖培養(yǎng)條件下的吸附蛋白。通過質(zhì)譜鑒定結(jié)果可以近似比較各蛋白相對(duì)的表達(dá)量。通過比較發(fā)現(xiàn)有部分蛋白在葡萄糖和纖維素培養(yǎng)條件下存在明顯差異。并且現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的影響纖維素降解的幾個(gè)重要蛋白均位于質(zhì)譜結(jié)果的前100位。Chutchinsonii 纖維素吸附蛋白的鑒定為尋找纖維素降解相關(guān)重要蛋白提供了參考。選取表達(dá)水平較高并且在纖維素培養(yǎng)條件下存在明顯上調(diào)的CHU_0344蛋白進(jìn)行研究。前期研究發(fā)現(xiàn)C.HU_0344蛋白既可以定位于細(xì)胞膜也可以分泌到細(xì)胞外。對(duì)chu_0344基因進(jìn)行敲除,發(fā)現(xiàn)敲除株纖維素吸附能力只有野生株的75%左右,并且菌體降解纖維素能力略有降低。這表明CHU_0344蛋白在菌體吸附纖維素過程中起作用,并影響纖維素的降解。3.chu_21 0基因功能及flexirubin色素生物學(xué)功能研究轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入突變技術(shù)是研究功能基因的常用手段。我們通過HimarEm3轉(zhuǎn)座子對(duì)C.hutchinsonii進(jìn)行插入突變,篩選到一株色素合成缺陷菌株。通過反向PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)插入位點(diǎn)位于chu2110(fabZ)基因�；匮a(bǔ)基因chu_2110使突變株色素合成表型恢復(fù)。fabZ基因編碼一個(gè)122氨基酸的蛋白。FabZ蛋白(YP_678715.1)標(biāo)注為β-羥酰-ACP脫水酶,在蛋白序列的N端有一個(gè)FabA_FabZ/hot_dog超家族的保守結(jié)構(gòu)域。通過SignalP4.1預(yù)測(cè)蛋白沒有信號(hào)肽,PSORTb預(yù)測(cè)蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中。β-羥酰-ACP脫水酶通常在II型脂肪酸合成的延伸過程中起所用。本文研究發(fā)現(xiàn)β-羥酰-ACP脫水酶FabZ在C.hutchinsonii flexirubin色素的多烯鏈的合成過程中起作用,在此過程中FabZ催化一個(gè)類似脂肪酸合成延伸過程的循環(huán)途徑。在C.hutchinsonii中含有兩個(gè)β-羥酰-ACP脫水酶:CHU_2110(FabZ)和CHU_0969(FabA)。其中fabZ位于色素合成相關(guān)基因簇中,而fbA位于脂肪酸代謝相關(guān)基因簇。在研究發(fā)現(xiàn)敲除fabA基因不會(huì)影響C.hutchinsonii flexirubin色素的合成。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在已報(bào)道的幾種產(chǎn)flexirubin色素菌體的色素合成基因簇中包含的均為fabZ基因。色素是微生物的重要次級(jí)代謝產(chǎn)物,flexirubin色素是擬桿菌分類學(xué)的重要標(biāo)記,我們研究了擬桿菌flexirubin色素的生物學(xué)功能。發(fā)現(xiàn)flexirubin色素具有抵抗氧化壓力和紫外線照射損傷的功能,這與其它色素功能類似。flexirubin色素的共軛多烯鏈和其它不飽和鍵可以發(fā)生還原反應(yīng)從而可以抵抗氧化劑和紫外照射產(chǎn)生的自由基。同時(shí)flexirubin色素還具有抵抗堿性條件壓力的作用,這一功能尚未在其它色素中報(bào)道。
[Abstract]:This paper studies the mechanism of cellulose degradation and its role in the degradation of cellulose . In recent years , the research on the mechanism of degradation and utilization of cellulose is the precondition for cellulose degradation . In this paper , we found that when 鈻，

本文編號(hào)：1398150