本文關(guān)鍵詞：代謝工程改造微生物合成甾體藥物中間體ADD和TS　出處：《江南大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：甾體藥物是僅次于抗生素的第二大類藥物,因其重要的生理活性,臨床上具有廣泛的應(yīng)用。雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)是重要甾體藥物中間體,可通過結(jié)構(gòu)上的化學(xué)修飾合成幾乎所有的甾體類藥物,在甾體藥物行業(yè)中的地位日益突出。然而由于底物投料濃度低,發(fā)酵轉(zhuǎn)化周期長及甾體微生物代謝機(jī)理認(rèn)知的不足等問題,我國在甾體微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)上仍明顯落后于歐美等國家,這嚴(yán)重制約了我國甾體藥物產(chǎn)業(yè)綠色轉(zhuǎn)型的步伐。因此,本論文以甾醇轉(zhuǎn)化過程關(guān)鍵酶為目標(biāo),對新金色分枝桿菌Myobacterium neoaurum轉(zhuǎn)化植物甾醇合成ADD過程中的關(guān)鍵酶3-甾酮-Δ1-脫氫酶(KSDD),膽固醇氧化酶(Cho M),甾酮C27單加氧酶(SMO)和3-甾酮-9α-羥化酶(KSH)進(jìn)行研究,利用代謝工程策略,實現(xiàn)了ADD的高效積累。此外,本研究對甾醇代謝產(chǎn)物進(jìn)行了拓展,將來源于人體中AD合成睪酮(TS)的途徑在畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá),實現(xiàn)了甾體藥物TS的生物學(xué)合成。主要內(nèi)容總結(jié)如下:1.課題組前期對M.neoaurum ST-095進(jìn)行誘變獲得菌株M.neoaurum JC-12,其轉(zhuǎn)化植物甾醇合成AD和ADD的總產(chǎn)量相同但摩爾比例不同,推測原因是催化AD到ADD的KSDD活性差異所導(dǎo)致。因此,本研究通過對誘變前后菌株KSDD氨基酸序列比對,發(fā)現(xiàn)M.neoaurum ST-095中KSDDI和M.neoaurum JC-12中KSDDII的不同在于氨基酸序列V366S的突變,該突變直接影響了KSDD活性�？莶菅挎邨U菌中異源表達(dá)和酶動力學(xué)分析表明V366S的突變使得KSDD對底物的親和性和催化效率提高進(jìn)而明顯提高酶活性。對KSDDI和KSDDII在新金色分枝桿菌中的功能進(jìn)行分析,證實該突變是引起菌株誘變前后產(chǎn)生不同AD和ADD摩爾比的原因。進(jìn)一步對KSDD催化活性中心結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)V366S的突變能夠減少底物與酶催化中心的空間位阻提高了KSDD的催化活性和穩(wěn)定性,進(jìn)而提高其酶活性。2.將M.neoaurum JC-12中的Cho M1和Cho M2基因在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行異源表達(dá),對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究,結(jié)果表明重組Cho M1和Cho M2的反應(yīng)最適p H和溫度均分別為7.5和37°C,Mg2+和Mn2+能夠明顯促進(jìn)其酶活性。動力學(xué)參數(shù)表明,和Cho M1相比,Cho M2對底物的親和力更強(qiáng),從而表現(xiàn)出更高的酶活性。利用構(gòu)建的重組菌B.subtilis 168/p MA5-cho M1和B.subtilis 168/p MA5-cho M2全細(xì)胞實現(xiàn)了膽固醇到4-膽甾烯-3-酮的轉(zhuǎn)化,24 h后產(chǎn)量分別為0.67 g·L~(-1)和0.83 g·L~(-1)。將Cho M2在M.neoaurum JC-12中過量表達(dá)以提高底物甾醇的攝取和轉(zhuǎn)化能力,最終ADD產(chǎn)量達(dá)到4.73 g·L~(-1),提高了37.1%。結(jié)果表明可以通過提高甾醇轉(zhuǎn)化菌株中Cho M活性來改良菌種的發(fā)酵特性,實現(xiàn)甾醇的高效轉(zhuǎn)化。3.鑒定了來源于新金色分枝桿菌的三個SMO同工酶SMO1,SMO2和SMO3具有甾醇側(cè)鏈末端氧化功能。對其進(jìn)行異源表達(dá)與純化,酶動力學(xué)分析表明SMO2對底物親和性更強(qiáng),催化效率更高。對三個同工酶基因的敲除和功能回補(bǔ)進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)缺陷菌株對底物甾醇的代謝速率受到明顯的抑制作用,證實了SMO是分枝桿菌甾醇側(cè)鏈轉(zhuǎn)化第一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶,其中SMO2在甾醇代謝過程中作用最為明顯。在M.neoaurum JC-12中分別過表達(dá)SMO1,SMO2和SMO3,考察過量表達(dá)SMO對菌株在甾醇轉(zhuǎn)化能力上的影響。結(jié)果表明SMO1,SMO2和SMO3過表達(dá)菌株ADD的產(chǎn)量分別從3.48 g·L~(-1)提高到4.49 g·L~(-1),4.96 g·L~(-1)和4.13 g·L~(-1),分別提高了29.0%,42.5%和18.7%,其中SMO2在提高ADD產(chǎn)量上效果最為明顯。結(jié)果表明可以通過提高SMO的酶活性來提高菌株轉(zhuǎn)化甾醇合成ADD的能力。4.利用代謝工程手段調(diào)控M.neoaurum JC-12轉(zhuǎn)化甾醇合成ADD的代謝途徑。首先敲除ksh A1基因使得KSH活性缺失,從而阻斷了ADD降解途徑,ADD產(chǎn)量從3.45g·L~(-1)提高到4.57 g·L~(-1),并且發(fā)酵后期ADD不再被降解。在KSH活性缺失的基礎(chǔ)上,通過共表達(dá)代謝途徑中的關(guān)鍵酶Cho M2,SMO2和KSDD提高甾醇代謝途徑中的代謝通量,最終獲得高效轉(zhuǎn)化植物甾醇合成ADD的重組菌JC-12S2-cho M2-ksdd。以20 g·L~(-1)植物甾醇作為底物進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化168 h,重組菌ADD的產(chǎn)量從6.55 g·L~(-1)提高到12.40 g·L~(-1),提高了89.3%。為了縮短發(fā)酵周期,提高ADD的生產(chǎn)效率,本研究在5-L發(fā)酵罐上對重組菌株的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。以果糖作為初始碳源,明顯消除重組菌生長延滯期,然后結(jié)合多階段發(fā)酵策略,最終180 h獲得20.1 g·L~(-1)的ADD,生產(chǎn)效率從0.074 g·(L·h)-1提高到0.112 g·(L·h)-1。這是目前文獻(xiàn)報道中利用甾醇轉(zhuǎn)化合成ADD的最高產(chǎn)量。同時發(fā)酵工藝技術(shù)手段具有廣泛的通用性和突出的應(yīng)用價值,理應(yīng)得到大力推廣。5.論文對甾體藥物及中間體睪酮(TS)的微生物合成進(jìn)行了初步研究。首先將來源于人體中AD合成TS的途徑在畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá),實現(xiàn)了TS的生物學(xué)合成。將經(jīng)密碼子優(yōu)化后的人體17β-羥基類固醇脫氫酶3(17β-HSD3)基因在畢赤酵母中進(jìn)行了異源活性表達(dá),驗證了其具有催化AD合成TS的功能,并且該催化反應(yīng)為不可逆反應(yīng)。然后在畢赤酵母中共表達(dá)17β-HSD3和釀酒酵母的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)構(gòu)建NADPH輔酶循環(huán)再生系統(tǒng)。以葡萄糖為輔底物,重組菌P.pastoris/17β-HSD3P-G6PDH全細(xì)胞能夠高效轉(zhuǎn)化AD合成TS。進(jìn)一步優(yōu)化其全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件:溫度為37°C,p H為7.5,底物最佳助溶劑為Me-β-CD,最適菌體生物量為200 g·L~(-1)(濕重),最適底物濃度為5 g·L~(-1)。在5-L發(fā)酵罐上利用分批補(bǔ)料策略轉(zhuǎn)化120 h,TS的終產(chǎn)量達(dá)到11.6 g·L~(-1),這是目前文獻(xiàn)報道中微生物法轉(zhuǎn)化合成TS的最高產(chǎn)量。結(jié)果表明畢赤酵母系統(tǒng)共表達(dá)目的酶蛋白和輔酶循環(huán)再生酶系可以作為合成其他甾體藥物的有效途徑。為實現(xiàn)由植物甾醇一步轉(zhuǎn)化合成TS,將密碼子優(yōu)化后的17β-hsd3基因轉(zhuǎn)化到高產(chǎn)AD的M.neoaurum ZADF-4中。然而遺憾的是,雖然表達(dá)出17β-HSD3目的蛋白,但是沒有酶活性,并且重組菌也不能夠轉(zhuǎn)化植物甾醇合成TS。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：TQ927

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1394854